Abstract Rapid advances in tissue clearing protocols have begun to outpace the capabilities of existing microscope objectives: High-resolution imaging inside cm-sized cleared samples is often not possible as it requires multi-immersion objectives with high numerical aperture (NA > 0.7), long working distance (WD > 10 mm) and a large field-of-view (FOV > 1 mm). Here, we introduce a novel mirror-based optical design, the “Schmidt objective”, which meets all these criteria despite containing only two optical elements. It consists of a spherical mirror in contact with the immersion medium and an aspherical correction plate. We showcase a multi-photon variant of a Schmidt objective that reaches NA 1.08 at an refractive index of 1.56 and demonstrate its versatility by imaging fixed samples in a wide range of immersion media ranging from air and water to BABB, DBE, and ECI. In addition, we demonstrate in vivo imaging by recording neuronal activity in larval zebrafish.

Abstract In 2015, we launched the mesoSPIM initiative ( www.mesospim.org ), an open-source project aimed at making light-sheet microscopes for large cleared tissues more accessible. Since then, the demand for imaging larger samples at higher speed and resolution has increased, requiring major improvements in the capabilities of light-sheet microscopy. Here, we introduce the next-generation mesoSPIM (“Benchtop”) with significantly increased field of view, improved resolution, and higher throughput compared to the original version. To this end, we developed a new method for testing objective lenses, enabling us to select detection objectives that are most suitable for light-sheet imaging with modern large-sensor sCMOS cameras (sensor diagonal up to 30 mm). The new mesoSPIM has a spatial resolution down to 1.5 µm laterally and 3.3 µm axially across the entire field of view, a magnification up to 20x, and sample sizes ranging from sub-mm up to multiple centimetres (e.g., a whole mouse), while being compatible with all clearing techniques. The microscope is designed as an open-source high-throughput system with a compact footprint, affordable cost, and assembly instructions aimed at non-experts. The user-friendly control software allows for acquisitions with multiple tiles, channels, and angles at high speed. We demonstrate several applications from neuroscience and developmental biology, as well as a novel use in physics, namely imaging particle tracks in transparent crystals that work as particle detectors.

Alterations of the retinoblastoma and/or the p53 signaling network are associated with specific cancers such as high-grade astrocytoma/glioblastoma, small cell lung cancer (SCLC), choroid plexus tumors and small-cell pancreatic neuroendocrine carcinoma (SC-PaNEC). However, the intricate functional compensation between RB1 and the related pocket proteins RBL1/p107 and RBL2/p130 in suppressing tumorigenesis remains poorly understood. Here we performed lineage-restricted parallel inactivation of rb1 and rbl1 by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in the true diploid Xenopus tropicalis to gain insight into these in vivo compensatory mechanisms. We show that while rb1 inactivation is sufficient to induce choroid plexus papilloma, combined rb1 and rbl1 inactivation is required and sufficient to drive SC-PaNEC, retinoblastoma and astrocytoma. Further, using a novel Li-Fraumeni syndrome-mimicking tp53 mutant X. tropicalis line, we demonstrate increased malignancy of retinoblastoma-mutant neural malignancies upon concomitant inactivation of tp53. Interestingly, although clinical SC-PaNEC samples are characterized by abnormal p53 expression or localization, in the current experimental models, the tp53 status had little effect on the establishment and growth of SC-PaNEC, but may rather be essential for maintaining chromosomal stability. SCLC was only rarely observed in our experimental set-up, indicating requirement of additional or alternative oncogenic insults. In conclusion, we used CRISPR/Cas9 to delineate the tumor suppressor properties of Rbl1 and generate new insights in functional compensation within the retinoblastoma protein family in suppressing pancreatic and specific neural cancers.

Identification of true dependencies in cancer is pivotal to the elucidation of novel therapeutic strategies to increase prospects for cancer patients. Unfortunately, in vivo identification of genetic dependencies has long relied on expensive and time-consuming breeding of genetically engineered animal models. Recently, in vitro CRISPR/Cas9 screens provided a new method for rapid and genome-wide identification of genetic dependencies. Nevertheless, genetic dependencies would ideally be identified using in vivo cancer models initiated by clinically relevant oncogenic driver or tumor suppressor insults. Here, we report a new methodology called CRISPR/Cas9-mediated Negative Selection Identification of genetic Dependencies (CRISPR-NSID) that allows in vivo elucidation of cancer cell vulnerabilities in genetic cancer models. The methodology hinges on the fact that for a genetic dependency there is an incapability for recovering tumors carrying biallelic frameshift mutations in this gene. We demonstrate how integrating experimentally determined, or in silico predicted, probabilities of frameshift editing for any given gRNA can be employed to ascertain negative selection pressure on inactivation of a genetic dependency during tumorigenesis. As a proof-of-principle, we use CRISPR-NSID to identify ezh2 and creb3l1 as genetic dependencies in desmoid tumors (desmoid-type fibromatosis) occurring in a Xenopus tropicalis cancer model driven by apc mutations. Bridging CRISPR-NSID to a clinically unmet need, we further demonstrate the promise for EZH2 inhibition as a new therapeutic strategy for desmoid tumors. This study establishes a new methodology for rapid identification of genetic dependencies in monoclonal disorders with wide adaptability to other model systems and organisms.