Abstract Optimum protein function and biochemical activity critically depends on water availability because solvent thermodynamics drive protein folding and macromolecular interactions 1 . Reciprocally, macromolecules restrict the movement of ‘structured’ water molecules within their hydration layers, reducing the available ‘free’ bulk solvent and therefore the total thermodynamic potential energy of water, or water potential. Here, within concentrated macromolecular solutions such as the cytosol, we found that modest changes in temperature greatly affect the water potential, and are counteracted by opposing changes in osmotic strength. This duality of temperature and osmotic strength enables simple manipulations of solvent thermodynamics to prevent cell death after extreme cold or heat shock. Physiologically, cells must sustain their activity against fluctuating temperature, pressure and osmotic strength, which impact water availability within seconds. Yet, established mechanisms of water homeostasis act over much slower timescales 2,3 ; we therefore postulated the existence of a rapid compensatory response. We find that this function is performed by water potential-driven changes in macromolecular assembly, particularly biomolecular condensation of intrinsically disordered proteins. The formation and dissolution of biomolecular condensates liberates and captures free water, respectively, quickly counteracting thermal or osmotic perturbations of water potential, which is consequently robustly buffered in the cytoplasm. Our results indicate that biomolecular condensation constitutes an intrinsic biophysical feedback response that rapidly compensates for intracellular osmotic and thermal fluctuations. We suggest that preserving water availability within the concentrated cytosol is an overlooked evolutionary driver of protein (dis)order and function.

Abstract The daily organisation of most mammalian cellular functions is attributed to circadian regulation of clock-controlled protein expression, driven by daily cycles of CRYPTOCHROME-dependent transcriptional feedback repression. To test this, we compared the circadian proteome and phosphoproteome of wild type and CRY-deficient fibroblast cells. Strikingly, CRY-deficient cells showed a two-fold increase in circadian-regulated proteins, phosphopeptides, and K + transport. This was accompanied by extensive remodelling of the cellular proteome overall, including reduced phosphatase and proteasome subunit expression. These adaptations rendered CRY-deficient cells more sensitive to stress, which may account for their reduced circadian robustness and contribute to the wide-ranging phenotypes of CRY-deficient mice. We suggest that CRY ultimately functions to suppress, rather than generate, daily rhythms in cellular protein abundance, thereby maintaining protein and osmotic homeostasis.

ABSTRACT Although costly to maintain, protein homeostasis is indispensable for normal cellular function and long-term health. In mammalian cells and tissues, daily variation in global protein synthesis has been observed, but its utility and consequences for proteome integrity are not fully understood. Using several different pulse-labelling strategies, here we gain direct insight into the relationship between protein synthesis and abundance proteome-wide. We show that protein degradation varies in-phase with protein synthesis, facilitating rhythms in turnover rather than abundance. This results in daily consolidation of proteome renewal whilst minimising changes in composition. Coupled rhythms in synthesis and turnover are especially salient to the assembly of macromolecular protein complexes, particularly the ribosome, the most abundant species of complex in the cell. Daily turnover and proteasomal degradation rhythms render cells and mice more sensitive to proteotoxic stress at specific times of day, potentially contributing to daily rhythms in the efficacy of proteasomal inhibitors against cancer. Our findings suggest that circadian rhythms function to minimise the bioenergetic cost of protein homeostasis through temporal consolidation of protein turnover.

Abstract Summary Circadian (approximately daily) rhythms are a pervasive property of mammalian cells, tissues, and behaviour, ensuring physiological and metabolic adaptation to solar time. Models of daily cellular timekeeping revolve around transcriptional feedback repression, whereby CLOCK and BMAL1 activate the expression of ‘clock proteins’ PERIOD (PER) and CRYPTOCHROME (CRY), which in turn repress CLOCK/BMAL1 activity. CRY proteins are thus considered essential negative regulators of the oscillation; a function supported by behavioural arrhythmicity of CRY-deficient mice when kept under constant conditions. Challenging this interpretation, however, we find evidence for persistent circadian rhythms in mouse behaviour and cellular PER2 levels when CRY is absent. CRY-less oscillations are variable in their expression and have a shorter period than wild type controls. Importantly, we find classic circadian hallmarks such as temperature compensation and determination of period by casein kinase 1δ/ε activity to be maintained. In the absence of CRY-mediated transcriptional feedback repression and rhythmic Per2 transcription, PER2 protein rhythms are sustained for several cycles, accompanied by circadian variation in protein stability. We suggest that, whereas circadian transcriptional feedback imparts robustness and functionality onto biological clocks, the core timekeeping mechanism is post-translational. Our findings suggest that PER proteins normally act as signalling hubs that transduce timing information to the nucleus, imparting daily rhythms upon the activity of transcriptional effectors. Highlights ➢ PER/CRY-mediated negative feedback is dispensable for mammalian circadian timekeeping ➢ Circadian variation in PER2 levels persists in the absence of rhythmic Per2 transcription ➢ CK1 and GSK3 are plausible mechanistic components of a ‘cytoscillator’ mechanism ➢ CRY-mediated feedback repression imparts robustness to biological timekeeping In brief Circadian turnover of mammalian clock protein PERIOD2 persists in the absence of canonical transcriptional feedback repression and rhythmic clock gene activity, demanding a re-evaluation of cellular clock function and evolution.

Summary Circadian rhythms result from cell-intrinsic timing mechanisms that impact health and disease 1,2 . To date, however, neural circadian research has largely focused on the hypothalamic circuitry of nocturnal rodents 3 . Whether circadian rhythms exist in human brain cells is unknown. Here we show bona fide circadian rhythms in human neurons, glia, cerebral organoids, and cerebral organoid slices (ALI-COs) 4–8 . Human neural circadian rhythms are synchronised by physiological timing cues such as glucocorticoids and daily temperature cycles, and these rhythms are temperature-compensated across the range of normal human brain temperatures 9 . Astrocyte rhythms are phase-advanced relative to other cultures and they modulate neuronal clock responses to temperature shift. Cerebral organoid rhythms are more robust at physiological brain temperatures; the relative amplitude of these rhythms increases over time in culture and their resetting capacity recapitulates key neurodevelopmental transitions in glucocorticoid signalling 10–14 . Remarkably, organoid post-transcriptional bioluminescent clock reporter rhythms are retained even when those of their putative transcriptional drivers are indiscernible 15 , and electrophysiology recordings confirm circadian rhythms in functional activity of monocultures, organoids, and ALI-COs. Around one third of the cerebral organoid proteome and phosphoproteome are circadian-rhythmic, with temporal consolidation of disease-relevant neural processes. Finally, we show that human brain organoid rhythms can be modulated and disrupted by commonly used brain-permeant drugs and mistimed cortisol exposure, respectively. Our results demonstrate that human brain cells and tissues develop their own circadian oscillations and that canonical mechanisms of the circadian clockwork may be inadequate to explain these rhythmic phenomena. 2D and 3D human neural cultures represent complementary and tractable models for exploring the emergence, disruption, and mechanics of the circadian neural clockwork, with important implications for chronobiology, brain function, and brain health.

Abstract Early mammals were nocturnal until the Cretaceous-Paleogene extinction facilitated their rapid expansion into daytime niches. Diurnality subsequently evolved multiple times, independently, but the mechanisms facilitating this switch are unknown. We found that physiological daily temperature shifts oppositely affect circadian clock rhythms in nocturnal versus diurnal mammals. This occurs through a cell-intrinsic signal inverter, mediated by global differences in protein phosphorylation, and effected at the level of bulk protein synthesis rates, with diurnal translation rate being less thermosensitive than nocturnal. Perturbations that reduce translational initiation or mTOR activity are sufficient to trigger the nocturnal-to-diurnal switch at the cellular, tissue, and organismal scale. Our results suggest a convergent selection pressure to attain diurnality by reducing the effect of temperature-dependent changes in protein synthesis on circadian clocks. One sentence summary Recalibrating the thermosensitivity of protein synthesis drives daytime-selective activity in mammals.

Background: Structural 'brain age' is a valuable but complex biomarker for several brain disorders. The dog is an unrivalled comparator for neurological disease modeling, however brain phenotypic diversity among pedigrees creates computational and statistical challenges. Methods: We applied unbiased network correlation analysis in dogs to explore complex interactions between brain morphometrics, patient metadata, and neurological disease. Twenty-four parameters measured from each of 286 brain magnetic resonance imaging scans generated 9,438 data points that were used to cluster canine patients according to their brain morphometry profiles. The network was then explored for statistically significant enrichments within breed, sex, age, and diagnostic categories. Findings: Morphometric comparisons revealed an advanced 'aged-brain' profile in the Boxer breed, consisting of a small brain length, width, and volume, combined with ventriculomegaly. Key features of this profile were paralleled in neutered female dogs which, relative to un-neutered females, had an 11-fold greater risk of developing primary brain tumours. Enrichment analysis confirmed that Boxers and geriatric individuals were enriched for brain tumour diagnoses, despite a lack of geriatric Boxers within the cohort. Interpretation: These findings suggest that accelerated brain ageing might contribute to tumour risk in Boxers and may be influenced by oestrogen deficiency -- a risk factor for dementia and brain tumours in humans. We propose that morphometric features of brain ageing in dogs, like humans, might better predict neurological disease risk than a patient's chronological age. Funding: Wellcome Trust Integrated Training Fellowship for Veterinarians (096409/Z/11/Z to N.M.R) and an MSD Animal Health Connect Bursary (to O.M.S.).