Abstract Background Deep sequencing of targeted genomic regions is becoming a common tool for understanding the dynamics and complexity of Plasmodium infections, but its lower limit of detection is currently unknown. Here, a new amplicon analysis tool, the Parallel Amplicon Sequencing Error Correction (PASEC) pipeline, is used to evaluate the performance of amplicon sequencing on low-density Plasmodium DNA samples. Illumina-based sequencing of two P. falciparum genomic regions ( CSP and SERA2 ) was performed on two types of samples: in vitro DNA mixtures mimicking low-density infections (1-200 genomes/μl) and extracted blood spots from a combination of symptomatic and asymptomatic individuals (44-653,080 parasites/μl). Three additional analysis tools—DADA2, HaplotypR, and SeekDeep—were applied to both datasets and the precision and sensitivity of each tool were evaluated. Results Amplicon sequencing can contend with low-density samples, showing reasonable detection accuracy down to a concentration of 5 Plasmodium genomes/μl. Due to increased stochasticity and background noise, however, all four tools showed reduced sensitivity and precision on samples with very low parasitemia (<5 copies/μl) or low read count (<100 reads per amplicon). PASEC could distinguish major from minor haplotypes with an accuracy of 90% in samples with at least 30 Plasmodium genomes/μl, but only 61% at low Plasmodium concentrations (<5 genomes/μl) and 46% at very low read counts (<25 reads per amplicon). The four tools were additionally used on a panel of extracted parasite-positive blood spots from natural malaria infections. While all four identified concordant patterns of complexity of infection (COI) across four sub-Saharan African countries, the COI values obtained for individual samples differed in some cases. Conclusions Amplicon deep sequencing can be used to determine the complexity and diversity of low-density Plasmodium infections. Despite differences in their approach, four state-of-the-art tools resolved known haplotype mixtures with similar sensitivity and precision. Researchers can therefore choose from multiple robust approaches for analyzing amplicon data, however, error filtration approaches should not be uniformly applied across samples of varying parasitemia. Samples with very low parasitemia and very low read count have higher false positive rates and call for read count thresholds that are higher than current recommendations.

As transmission intensity has declined in Senegal, so has the genetic complexity of circulating Plasmodium falciparum parasites, resulting in specific genotypes emerging and persisting over years. We address whether changes in parasite genetic signatures can alter the immune repertoire to variant surface antigens, and whether such responses can influence the expansion or contraction of specific parasite genotypes in the population. We characterize parasites within genotypic clusters, defined as identical by a 24-SNP molecular barcode and a haplotype identifier for other highly polymorphic loci; we measure expression of variant surface antigens (VSA) such as PfEMP-1 by transcript expression typing and expressed var DBLα sequencing in ex vivo and short-term adapted RNA samples; and we measure IgG responses against VSAs from short-term adapted parasites. We find that parasites within genotypic clusters are genetically identical at other highly polymorphic loci. These parasites express similar Ups var classes and largely the same dominant var DBLα sequences ex vivo. These parasites are recognized similarly by anti-VSA antibodies after short-term adaptation to culture; however, antibody responses do not correlate with genotype frequencies over time. Both genotype-specific and multiple genotype-reactive surface IgG responses are observed in this population. Parasites with identical genomes are extremely similar in their expression and host antibody recognition of VSAs. Monitoring changes in population-level parasite genomics and transmission dynamics is critical, as fluctuations will influence the breadth of resulting host immune responses to circulating parasite genotypes. These findings suggest shared immune recognition of genetically similar parasites, which has implications for both our understanding of immunity and vaccine development strategies in malaria elimination settings.

ABSTRACT Long-read sequencing (LRS) technologies have the potential to revolutionize scientific discoveries in RNA biology, especially by enabling the comprehensive identification and quantification of full length mRNA isoforms. However, inherently high error rates make the analysis of long-read sequencing data challenging. While these error rates have been characterized for sequence and splice site identification, it is still unclear how accurately LRS reads represent transcript start and end sites. Here, we systematically assess the variability and accuracy of mRNA terminal ends identified by LRS reads across multiple sequencing platforms. We find substantial inconsistencies in both the start and end coordinates of LRS reads spanning a gene, such that LRS reads often fail to accurately recapitulate annotated or empirically derived terminal ends of mRNA molecules. To address this challenge, we introduce an approach to condition reads based on empirically derived terminal ends and identified a subset of reads that are more likely to represent full-length transcripts. Our approach can improve transcriptome analyses by enhancing the fidelity of transcript terminal end identification, but may result in lower power to quantify genes or discover novel isoforms. Thus, it is necessary to be cautious when selecting sequencing approaches and/or interpreting data from long-read RNA sequencing.