NOTE: In the version of this Brief Communication initially published, an author name (Lukas Mueller) was incorrect. The correct author name is Lukas N Mueller. The error has been corrected in the HTML and PDF versions of the article. We describe a method to identify cross-linked peptides from complex samples and large protein sequence databases by combining isotopically tagged cross-linkers, chromatographic enrichment, targeted proteomics and a new search engine called xQuest. This software reduces the search space by an upstream candidate-peptide search before the recombination step. We showed that xQuest can identify cross-linked peptides from a total Escherichia coli lysate with an unrestricted database search.

Summary The chromatin-binding protein 53BP1 promotes DNA repair by orchestrating the recruitment of downstream effectors including PTIP, RIF1 and shieldin to DNA double-strand break sites. While how PTIP recognizes 53BP1 is known, the molecular details of RIF1 recruitment to DNA damage sites remains undefined. Here, we report that RIF1 is a phosphopeptide-binding protein that directly interacts with three phosphorylated 53BP1 epitopes. The RIF1-binding sites on 53BP1 share an essential LxL motif followed by two closely apposed phosphorylated residues. Simultaneous mutation of these sites on 53BP1 abrogates RIF1 accumulation into ionizing radiation-induced foci, but surprisingly only fully compromises 53BP1-dependent DNA repair when an alternative mode of shieldin recruitment to DNA damage sites is also disabled. Intriguingly, this alternative mode of recruitment still depends on RIF1 but does not require its interaction with 53BP1. RIF1 therefore employs phosphopeptide recognition to promote DNA repair but also modifies shieldin action independently of 53BP1 binding.

ABSTRACT We describe einprot, an R package providing easy-to-use reproducible workflows for quality control, statistical analysis and visualization of quantitative proteomics data. einprot is applicable to tabular output from MaxQuant, Proteome Discoverer and FragPipe, and a single function call generates an html report that describes the full analysis pipeline applied to the data and contains static and interactive figures and tables for further exploration. This has the potential to facilitate routine analyses as well as to provide a standardized, yet comprehensive way to communicate results to collaborators and the broader community. The source file underlying the report is also returned, giving the user full flexibility to further modify the workflow according to their needs.

Abstract The RNA-binding protein TRIM71/LIN-41 is a phylogenetically conserved developmental regulator that functions in mammalian stem cell reprogramming, brain development and cancer. TRIM71 recognizes target mRNAs through hairpin motifs and silences them through molecular mechanisms that await identification. Here, we uncover that TRIM71 silences its targets by recruiting TNRC6/GW182, a core component of the miRNA-induced silencing complex (miRISC). Co-immunoprecipitation reveals interaction of TNRC6A with additional RNA-binding proteins and we demonstrate that AGO2, TRIM71, and UPF1 each recruit TNRC6 to specific, largely distinct sets of transcripts to silence them. As cellular TNRC6 levels are limiting, competition occurs among the silencing pathways, such that loss of AGO2 protein, or of AGO2 binding to TNRC6, enhances the activities of the other pathways. We conclude that a miRNA-like silencing activity is shared among different mRNA silencing pathways and that use of TNRC6 as a central hub provides a means to integrate their activities.

Substrate specificity determines protease functions in physiology and in clinical and biotechnological application. However, affordable and unbiased assays for large-scale quantification of substrate cleavage have been lacking. Here, we develop hiMAPS (high-throughput mapping of protease cleavage sites), a cheap, mass spectrometry-based assay, to derive cleavage motifs for human Dipeptidyl Peptidase Four (DPP4), a key regulator of blood glucose levels. We recapitulate the known benefit of proline in the penultimate (P1) position from the substrate N-terminus, extend it to additional residues, and identify and quantify combinatorial interactions of P1 with its neighbors. These findings reveal extensive cooperativity among the enzyme9s active site subsites and allow us to derive a sequence motif that predicts substrate turnover. We show that this information provides new opportunities to engineer stabilized versions of a key substrate of DPP4, the small peptide hormone GLP-1, whose derivatives are used for clinical treatment of type 2 diabetes and obesity. Finally, structural and biochemical characterization of a DPP4 homologue, C. elegans DPF-3, reveal specific subsite differences and a distinct cleavage motif, providing insight into the mechanistic basis of the observed specificity. Collectively, our findings present a broadly applicable framework to high-throughput mapping of protease cleavage sites, extend our understanding of protease specificity, and provide a chemical space for substrate engineering of a clinically relevant family of exopeptidases.

SUMMARY Transcription factors (TFs) are key regulators of gene expression, yet many of their targets and modes of action remain unknown. In Schizosaccharomyces pombe , one-third of TFs are solely homology-predicted, with few experimentally validated. We created a comprehensive library of 89 endogenously tagged S. pombe TFs, mapping their protein and chromatin interactions using immunoprecipitation-mass spectrometry and chromatin immunoprecipitation sequencing. Our study identified protein interactors for half the TFs, with over a quarter potentially forming stable complexes. We discovered DNA binding sites for most TFs across 2,027 unique genomic regions, revealing motifs for 38 TFs and uncovering a complex regulatory network of extensive TF cross- and autoregulation. Characterization of the largest TF family revealed conserved DNA sequence preferences but diverse binding patterns, and identified a repressive heterodimer, Ntu1/Ntu2, linked to perinuclear gene localization. Our TFexplorer webtool makes all data interactively accessible, offering new insights into TF interactions and regulatory mechanisms with broad biological relevance. HIGHLIGHTS Comprehensive strain library of endogenously tagged S. pombe TFs Experimentally determined atlas of TF interactions with proteins and chromatin TFexplorer web application for interactive exploration of TF interactomes Identification of repressive Nattou complex linked to perinuclear gene localization