Abstract The Chloroflexi superphylum have been investigated primarily from the perspective of reductive dehalogenation of toxic compounds, anaerobic photosynthesis and wastewater treatment, but remain relatively little studied compared to their close relatives within the larger Terrabacteria group, including Cyanobacteria, Actinobacteria, and Firmicutes. Here, we conducted a detailed phylogenetic analysis of the phylum Chloroflexota, the phylogenetically proximal candidate phylum Dormibacteraeota , and a newly defined sibling phylum proposed in the current study, Eulabeiota . These groups routinely root together in phylogenomic analyses, and constitute the Chloroflexi supergroup. Chemoautotrophy is widespread in Chloroflexi. Two Form I Rubisco ancestral subtypes that both lack the small subunit are prevalent in ca. Eulabeiota and Chloroflexota , suggesting that the predominant modern pathway for CO 2 fixation evolved in these groups. The single subunit Form I Rubiscos are inferred to have evolved prior to oxygenation of the Earth’s atmosphere and now predominantly occur in anaerobes. Prevalent in both Chloroflexota and ca. Eulabeiota are capacities related to aerobic oxidation of gases, especially CO and H 2 . In fact, aerobic and anaerobic CO dehydrogenases are widespread throughout every class-level lineage, whereas traits such as denitrification and reductive dehalogenation are heterogeneously distributed across the supergroup. Interestingly, some Chloroflexota have a novel clade of group 3 NiFe hydrogenases that is phylogenetically distinct from previously reported groups. Overall, the analyses underline the very high level of metabolic diversity in the Chloroflexi supergroup, suggesting the ancestral metabolic platform for this group enabled highly varied adaptation to ecosystems that appeared in the aerobic world.

Summary Anaerobic methane oxidation exerts a key control on greenhouse gas emissions 1 , yet factors that modulate the activity of microorganisms performing this function remain little explored. In studying groundwater, sediments, and wetland soil where methane production and oxidation occur, we discovered extraordinarily large, diverse DNA sequences that primarily encode hypothetical proteins. Four curated, complete genomes are linear, up to ~1 Mbp in length and share genome organization, including replicore structure, long inverted terminal repeats, and genome-wide unique perfect tandem direct repeats that are intergenic or generate amino acid repeats. We infer that these are a new type of archaeal extrachromosomal element with a distinct evolutionary origin. Gene sequence similarity, phylogeny, and local divergence of sequence composition indicate that many of their genes were assimilated from methane-oxidizing Methanoperedens archaea. We refer to these elements as “Borgs”. We identified at least 19 different Borg types coexisting with Methanoperedens in four distinct ecosystems. Borg genes expand redox and respiratory capacity (e.g., clusters of multiheme cytochromes), ability to respond to changing environmental conditions, and likely augment Methanoperedens capacity for methane oxidation (e.g., methyl coenzyme M reductase). By this process, Borgs could play a previously unrecognized role in controlling greenhouse gas emissions.

Abstract Anaerobic methanotrophic (ANME) archaea conserve energy from the breakdown of methane, an important driver of global warming, yet the extrachromosomal genetic elements that impact the activities of ANME archaea are little understood. Here we describe large plasmids associated with ANME archaea of the Methanoperedens genus. These have been maintained in two bioreactors that contain enrichment cultures dominated by different Methanoperedens species and co-occur with Methanoperedens species in other anoxic environments. By manual curation we show that two of the plasmids are large (155,607 bp and 191,912 bp), circular, and replicate bidirectionally. The group of Methanoperedens species that carry these plasmids is related to “ Ca . Methanoperedens nitroreducens”, “ Ca . Methanoperedens ferrireducens”, “ Ca . Methanoperedens manganicus" and the plasmids occur in the same copy number as the main chromosome. The larger plasmid encodes transporters that potentially enhance access to Ni, which is required for the methyl-CoM reductase (Mcr), Co required for the cobalamin cofactor needed for methyltransferases, and amino acid uptake. We show that many plasmid genes are actively transcribed, including genes involved in plasmid chromosome maintenance and segregation, a Co 2+ /Ni 2+ transporter and cell protective proteins. Notably, one plasmid carries three tRNAs and two colocalized genes encoding ribosomal protein uL16 and elongation factor eEF2. These are not encoded in the host Methanoperedens genome and uL16 and eEF2 were highly expressed, indicating an obligate interdependence between this plasmid and its host. The finding of plasmids of Methanoperedens opens the way for the development of genetic vectors that could be used to probe little understood aspects of Methanoperedens physiology. Ultimately, this may provide a route to introduce or alter genes that may enhance growth and overall metabolism to accelerate methane oxidation rates.

Microbial hydrogen (H2) cycling underpins the diversity and functionality of diverse anoxic ecosystems. Among the three evolutionarily distinct hydrogenase superfamilies responsible, [FeFe] hydrogenases were thought to be restricted to bacteria and eukaryotes. Here, we show that anaerobic archaea encode diverse, active, and ancient lineages of [FeFe] hydrogenases through combining analysis of existing and new genomes with extensive biochemical experiments. [FeFe] hydrogenases are encoded by genomes of nine archaeal phyla and expressed by H2-producing Asgard archaeon cultures. We report an ultraminimal hydrogenase in DPANN archaea that binds the catalytic H-cluster and produces H2. Moreover, we identify and characterize remarkable hybrid complexes formed through the fusion of [FeFe] and [NiFe] hydrogenases in ten other archaeal orders. Phylogenetic analysis and structural modeling suggest a deep evolutionary history of hybrid hydrogenases. These findings reveal new metabolic adaptations of archaea, streamlined H2 catalysts for biotechnological development, and a surprisingly intertwined evolutionary history between the two major H2-metabolizing enzymes.

ABSTRACT Microbial communities in lakes can profoundly impact biogeochemical processes through their individual activities and collective interactions. However, the complexity of these communities poses challenges, particularly for studying rare members. Laboratory enrichments can select for subsystems of interacting organisms and enable genome recovery for enriched populations. Here, a reactor inoculated with water from Lake Fargette, France, and maintained under dark conditions at 4°C for 31 months enriched for diverse Planctomycetes and Candidate Phyla Radiation (CPR) bacteria. We reconstructed draft genomes and predicted metabolic traits for 12 diverse Planctomycetes and 9 CPR bacteria, some of which are likely representatives of undescribed families or genera. One CPR genome representing the little-studied lineage Peribacter (1.239 Mbp) was curated to completion, and unexpectedly, encodes the full gluconeogenesis pathway. Metatranscriptomic data indicate that some Planctomycetes and CPR bacteria were active under the culture conditions. We also reconstructed genomes and obtained transmission electron microscope images for numerous phages, including one with a >300 kbp genome and several predicted to infect Planctomycetes. Together, our analyses suggest that freshwater Planctomycetes may act as hubs for interaction networks that include symbiotic CPR bacteria and phages.

Abstract Human milk oligosaccharides (HMOs) ensure proper infant gut microbiome establishment. Isolate studies have revealed the genetic basis for HMO metabolism, but they exclude the possibility of HMO assimilation via synergistic interactions involving multiple organisms. Here, we investigated microbiome responses to 2’-fucosyllactose (2’FL), a prevalent HMO and infant formula additive, by establishing individualized microbiomes using fecal samples from three different infants as the inocula. Bifidobacterium breve , a prominent member of infant microbiomes, typically cannot metabolize 2’FL. Using metagenomic data, we predicted that extracellular fucosidases encoded by co-existing members such as Ruminococcus gnavus initiate 2’FL breakdown, thus critical for B. breve’s growth. Using both targeted co-cultures and by supplementation of R. gnavus into one microbiome, we show that R. gnavus can promote extensive growth of B. breve through the release of lactose from 2’FL. Overall, microbiome cultivation combined with genome-resolved metagenomics demonstrated that HMO utilization can vary with an individual’s microbiome.

Methane emissions are mitigated by anaerobic methane-oxidizing archaea, including Methanoperedens. Some Methanoperedens host huge extrachromosomal genetic elements (ECEs) called Borgs that may modulate their activity, yet the broader diversity of Methanoperedens ECEs is understudied. Here we report small enigmatic linear ECEs, circular viruses and unclassified ECEs that are predicted to replicate within Methanoperedens. Linear ECEs have inverted terminal repeats, tandem repeats and coding patterns that are strongly reminiscent of Borgs, but they are only 52-145 kb in length. As they share proteins with Borgs and Methanoperedens, we refer to them as mini-Borgs. Mini-Borgs are genetically diverse and can be assigned to at least five family-level groups. We identify eight families of Methanoperedens viruses, some of which encode multi-haem cytochromes, and circular ECEs encoding transposon-associated TnpB genes with proximal population-heterogeneous CRISPR arrays. These ECEs exchange genetic information with each other and with Methanoperedens, probably impacting their archaeal host activity and evolution.

Abstract Methane emissions that contribute to climate change can be mitigated by anaerobic methane-oxidizing archaea such as Methanoperedens . Some Methanoperedens have huge extrachromosomal genetic elements (ECEs) called Borgs that may modulate their activity, yet the broader diversity of Methanoperedens ECEs is little studied. Here, we report small enigmatic linear ECEs, circular viruses and unclassified ECEs, that we predict replicate within Methanoperedens . The linear ECEs have features such as inverted terminal repeats, pervasive tandem repeats, and coding patterns that are strongly reminiscent of Borgs, but they are only 52 kb to 145 kb in length. They share proteins with Borgs and Methanoperedens . Thus, we refer to them as mini-Borgs. Mini-Borgs are genetically diverse and we assign them to at least five family-level groups. We also identify eight novel families of Methanoperedens viruses, some of which encode multiheme cytochromes, and unclassified circular ECEs that encode TnpB genes. A population-heterogeneous CRISPR array is in close proximity to the TnpB and has spacers that target other Methanoperedens ECEs including previously reported plasmids. The diverse groups of ECEs exchange genetic information with each other and with Methanoperedens , likely impacting the activity and evolution of these environmentally important archaea.

Abstract Borgs are huge extrachromosomal elements (ECE) of anaerobic methane-consuming “ Candidatus Methanoperedens” archaea. Here, we used nanopore sequencing to validate published complete genomes curated from short reads and to reconstruct new genomes. 13 complete and four near-complete linear genomes share 40 genes that define a largely syntenous genome backbone. We use these conserved genes to identify new Borgs from peatland soil and to delineate Borg phylogeny, revealing two major clades. Remarkably, Borg genes encoding nanowire-like electron-transferring cytochromes and cell surface proteins are more highly expressed than those of host Methanoperedens , indicating that Borgs augment the Methanoperedens activity in situ. We reconstructed the first complete 4.00 Mbp genome for a Methanoperedens that is inferred to be a Borg host and predicted its methylation motifs, which differ from pervasive TC and CC methylation motifs of the Borgs. Thus, methylation may enable Methanoperedens to distinguish their genomes from those of Borgs. Very high Borg to Methanoperedens ratios and structural predictions suggest that Borgs may be capable of encapsulation. The findings clearly define Borgs as a distinct class of ECE with shared genomic signatures, establish their diversification from a common ancestor with genetic inheritance, and raise the possibility of periodic existence outside of host cells.

Abstract Borgs are huge extrachromosomal elements (ECE) of anaerobic methane-consuming “ Candidatus Methanoperedens” archaea. Here, we used nanopore sequencing to validate published complete genomes curated from short reads and to reconstruct new genomes. 13 complete and four near-complete linear genomes share 40 genes that define a largely syntenous genome backbone. We use these conserved genes to identify new Borgs from peatland soil and to delineate Borg phylogeny, revealing two major clades. Remarkably, Borg genes encoding OmcZ nanowire-like electron-exporting cytochromes and cell surface proteins are more highly expressed than those of host Methanoperedens , indicating that Borgs augment the Methanoperedens activity in situ . We reconstructed the first complete 4.00 Mbp genome for a Methanoperedens that is inferred to be a Borg host and predicted its methylation motifs, which differ from pervasive TC and CC methylation motifs of the Borgs. Thus, methylation may enable Methanoperedens to distinguish their genomes from those of Borgs. Very high Borg to Methanoperedens ratios and structural predictions suggest that Borgs may be capable of encapsulation. The findings clearly define Borgs as a distinct class of ECE with shared genomic signatures, establish their diversification from a common ancestor with genetic inheritance, and raise the possibility of periodic existence outside of host cells.