Imaging is used to map activity across populations of neurons. Microscopes with cellular resolution have small (<1 millimeter) fields of view and cannot simultaneously image activity distributed across multiple brain areas. Typical large field of view microscopes do not resolve single cells, especially in the axial dimension. We developed a 2-photon random access mesoscope (2p-RAM) that allows high-resolution imaging anywhere within a volume spanning multiple brain areas (∅ 5 mm x 1 mm cylinder). 2p-RAM resolution is near diffraction limited (lateral, 0.66 μm, axial 4.09 μm at the center; excitation wavelength = 970 nm; numerical aperture = 0.6) over a large range of excitation wavelengths. A fast three-dimensional scanning system allows efficient sampling of neural activity in arbitrary regions of interest across the entire imaging volume. We illustrate the use of the 2p-RAM by imaging neural activity in multiple, non-contiguous brain areas in transgenic mice expressing protein calcium sensors.

Summary The active properties of dendrites support local nonlinear operations, but previous imaging and electrophysiological measurements have produced conflicting views regarding the prevalence of local nonlinearities in vivo . We imaged calcium signals in pyramidal cell dendrites in the motor cortex of mice performing a tactile decision task. A custom microscope allowed us to image the soma and up to 300 μm of contiguous dendrite at 15 Hz, while resolving individual spines. New analysis methods were used to estimate the frequency and spatial scales of activity in dendritic branches and spines. The majority of dendritic calcium transients were coincident with global events. However, task-associated calcium signals in dendrites and spines were compartmentalized by dendritic branching and clustered within branches over approximately 10 μm. Diverse behavior-related signals were intermingled and distributed throughout the dendritic arbor, potentially supporting a large computational repertoire and learning capacity in individual neurons.

Representation learning in neural networks may be implemented with supervised or unsupervised algorithms, distinguished by the availability of feedback. In sensory cortex, perceptual learning drives neural plasticity, but it is not known if this is due to supervised or unsupervised learning. Here we recorded populations of up to 90,000 neurons simultaneously from the primary visual cortex (V1) and higher visual areas (HVA), while mice learned multiple tasks as well as during unrewarded exposure to the same stimuli. Similar to previous studies, we found that neural changes in task mice were correlated with their behavioral learning. However, the neural changes were mostly replicated in mice with unrewarded exposure, suggesting that the changes were in fact due to unsupervised learning. The neural plasticity was concentrated in the medial HVAs and obeyed visual, rather than spatial, learning rules. In task mice only, we found a ramping reward prediction signal in anterior HVAs, potentially involved in supervised learning. Our neural results predict that unsupervised learning may accelerate subsequent task learning, a prediction which we validated with behavioral experiments.

Abstract Two-photon microscopy together with fluorescent proteins and fluorescent protein-based biosensors are commonly used tools in neuroscience. To enhance their experimental scope, it is important to optimize fluorescent proteins for two-photon excitation. Directed evolution of fluorescent proteins under one-photon excitation is common, but many one-photon properties do not correlate with two-photon properties. A simple system for expressing fluorescent protein mutants is E. coli colonies on an agar plate. The small focal volume of two-photon excitation makes creating a high throughput screen in this system a challenge for a conventional point-scanning approach. We present an instrument and accompanying software that solves this challenge by selectively scanning each colony based on a colony map captured under one-photon excitation. This instrument, called the GIZMO, can measure the two-photon excited fluorescence of 10,000 E. coli colonies in 7 hours. We show that the GIZMO can be used to evolve a fluorescent protein under two-photon excitation.

Cognitive maps confer animals with flexible intelligence by representing spatial, temporal, and abstract relationships that can be used to shape thought, planning, and behavior. Cognitive maps have been observed in the hippocampus, but their algorithmic form and the processes by which they are learned remain obscure. Here, we employed large-scale, longitudinal two-photon calcium imaging to record activity from thousands of neurons in the CA1 region of the hippocampus while mice learned to efficiently collect rewards from two subtly different versions of linear tracks in virtual reality. The results provide a detailed view of the formation of a cognitive map in the hippocampus. Throughout learning, both the animal behavior and hippocampal neural activity progressed through multiple intermediate stages, gradually revealing improved task representation that mirrored improved behavioral efficiency. The learning process led to progressive decorrelations in initially similar hippocampal neural activity within and across tracks, ultimately resulting in orthogonalized representations resembling a state machine capturing the inherent structure of the task. We show that a Hidden Markov Model (HMM) and a biologically plausible recurrent neural network trained using Hebbian learning can both capture core aspects of the learning dynamics and the orthogonalized representational structure in neural activity. In contrast, we show that gradient-based learning of sequence models such as Long Short-Term Memory networks (LSTMs) and Transformers do not naturally produce such orthogonalized representations. We further demonstrate that mice exhibited adaptive behavior in novel task settings, with neural activity reflecting flexible deployment of the state machine. These findings shed light on the mathematical form of cognitive maps, the learning rules that sculpt them, and the algorithms that promote adaptive behavior in animals. The work thus charts a course toward a deeper understanding of biological intelligence and offers insights toward developing more robust learning algorithms in artificial intelligence.

Imaging is used to map activity across populations of neurons. Microscopes with cellular resolution have small (< 1 millimeter) fields of view and cannot simultaneously image activity distributed across multiple brain areas. Typical large field of view microscopes do not resolve single cells, especially in the axial dimension. We developed a 2-photon random access mesoscope (2p-RAM) that allows high-resolution imaging anywhere within a volume spanning multiple brain areas (∅ 5 mm x 1 mm cylinder). 2p-RAM resolution is near diffraction limited (lateral, 0.66 μm, axial 4.09 μm at the center; excitation wavelength = 970 nm; numerical aperture = 0.6) over a large range of excitation wavelengths. A fast three-dimensional scanning system allows efficient sampling of neural activity in arbitrary regions of interest across the entire imaging volume. We illustrate the use of the 2p-RAM by imaging neural activity in multiple, non-contiguous brain areas in transgenic mice expressing protein calcium sensors.

Point-scanning two-photon microscopy enables high-resolution imaging within scattering specimens such as the mammalian brain, but sequential acquisition of voxels fundamentally limits imaging speed. We developed a two-photon imaging technique that scans lines of excitation across a focal plane at multiple angles and uses prior information to recover high-resolution images at over 1.4 billion voxels per second. Using a structural image as a prior for recording neural activity, we imaged visually-evoked and spontaneous glutamate release across hundreds of dendritic spines in mice at depths over 250 microns and frame-rates over 1 kHz. Dendritic glutamate transients in anaesthetized mice are synchronized within spatially-contiguous domains spanning tens of microns at frequencies ranging from 1-100 Hz. We demonstrate high-speed recording of acetylcholine and calcium sensors, 3D single-particle tracking, and imaging in densely-labeled cortex. Our method surpasses limits on the speed of raster-scanned imaging imposed by fluorescence lifetime.