Abstract Cells and tissues are made out of nanoscale building blocks, such as proteins, organized in crowded nanostructures. We show that many biomolecules, and the nanostructures in which they are embedded, may be invisible to prior imaging techniques, due to the inaccessibility of labels (e.g., antibodies) to biomolecules embedded within such crowded structures. We developed a technology, expansion revealing (ExR), which isotropically decrowds proteins from each other, to enable their labeling. We use ExR to discover the alignment of presynaptic calcium channels with postsynaptic machinery in intact brain circuits, as well as the existence of periodic amyloid nanoclusters containing ion channel proteins in Alzheimer’s model mice. Thus, ExR reveals nanostructures within complex biological specimens that were not previously visualizable, and may find broad use in biology. One Sentence Summary De-crowding biomolecules with Expansion Revealing unmasks fundamentally new nanostructures in intact brain tissue, which remained invisible otherwise.

SUMMARY Non-invasive G amma EN trainment U sing S ensory stimuli (GENUS) at 40Hz reduced Alzheimer’s disease (AD) pathology, prevented cerebral atrophy and improved performance during behavioral testing in mouse models of AD. We report data from a safety study ( NCT04042922 ) and a randomized, placebo-controlled trial in participants with probable mild AD dementia after 3 months of one-hour daily 40Hz light and sound GENUS ( NCT04055376 ) to assess safety, compliance, entrainment and possible effects on brain structure, function, sleep and cognitive function. GENUS was well-tolerated and compliance was high in both groups. Electroencephalography recordings show that our GENUS device safely and effectively induced 40Hz entrainment in cognitively normal subjects and participants with mild AD. After 3 months of daily stimulation, participants with mild AD in the 40Hz GENUS group showed less ventricular enlargement and stabilization of the hippocampal size compared to the control group. Functional connectivity increased in both the default mode network and the medial visual network after 3 months of stimulation. Circadian rhythmicity also improved with GENUS. Compared to controls, the active group performed better on the face-name association delayed recall test. These results suggest that 40Hz GENUS can be used safely at home daily and shows favorable outcomes on cognitive function, daily rhythms, and structural and functional MRI biomarkers of AD-related degeneration. These results support further evaluation of GENUS in larger and longer clinical trials to evaluate its potential as a disease modifying therapeutic for Alzheimer’s disease.

The glymphatic movement of fluid through the brain removes metabolic waste1-4. Noninvasive 40 Hz stimulation promotes 40 Hz neural activity in multiple brain regions and attenuates pathology in mouse models of Alzheimer's disease5-8. Here we show that multisensory gamma stimulation promotes the influx of cerebrospinal fluid and the efflux of interstitial fluid in the cortex of the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Influx of cerebrospinal fluid was associated with increased aquaporin-4 polarization along astrocytic endfeet and dilated meningeal lymphatic vessels. Inhibiting glymphatic clearance abolished the removal of amyloid by multisensory 40 Hz stimulation. Using chemogenetic manipulation and a genetically encoded sensor for neuropeptide signalling, we found that vasoactive intestinal peptide interneurons facilitate glymphatic clearance by regulating arterial pulsatility. Our findings establish novel mechanisms that recruit the glymphatic system to remove brain amyloid.

Abstract Thousands of genetic variants acting in multiple cell types underlie complex disorders, yet most gene expression studies profile only bulk tissues, making it hard to resolve where genetic and non-genetic contributors act. This is particularly important for psychiatric and neurodegenerative disorders that impact multiple brain cell types with highly-distinct gene expression patterns and proportions. To address this challenge, we develop a new framework, SPLITR, that integrates single-nucleus and bulk RNA-seq data, enabling phenotype-aware deconvolution and correcting for systematic discrepancies between bulk and single-cell data. We deconvolved 3,387 post-mortem brain samples across 1,127 individuals and in multiple brain regions. We find that cell proportion varies across brain regions, individuals, disease status, and genotype, including genetic variants in TMEM106B that impact inhibitory neuron fraction and 4,757 cell-type-specific eQTLs. Our results demonstrate the power of jointly analyzing bulk and single-cell RNA-seq to provide insights into cell-type-specific mechanisms for complex brain disorders.

We profile genome-wide histone 3 lysine 27 acetylation (H3K27ac) of 3 major brain cell types from hippocampus and dorsolateral prefrontal cortex (dlPFC) of subjects with and without Alzheimer’s Disease (AD). We confirm that single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with late onset AD (LOAD) prefer to reside in the microglial histone acetylome, which varies most strongly with age. We observe acetylation differences associated with AD pathology at 3,598 peaks, predominantly in an oligodendrocyte-enriched population. Strikingly, these differences occur at the promoters of known early onset AD (EOAD) risk genes ( APP, PSEN1, PSEN2, BACE1 ), late onset AD (LOAD) risk genes ( BIN1, PICALM, CLU, ADAM10, ADAMTS4, SORL1 and FERMT2 ), and putative enhancers annotated to other genes associated with AD pathology ( MAPT ). More broadly, acetylation differences in the oligodendrocyte-enriched population occur near genes in pathways for central nervous system myelination and oxidative phosphorylation. In most cases, these promoter acetylation differences are associated with differences in transcription in oligodendrocytes. Overall, we reveal deregulation of known and novel pathways in AD and highlight genomic regions as therapeutic targets in oligodendrocytes of hippocampus and dlPFC.

Abstract The human hippocampal formation plays a central role in Alzheimer’s disease (AD) progression, cognitive traits, and the onset of dementia; yet its molecular states in AD remain uncharacterized. Here, we report a comprehensive single-cell transcriptomic dissection of the human hippocampus and entorhinal cortex across 489,558 cells from 65 individuals with varying stages of AD pathology. We transcriptionally characterize major brain cell types and neuronal classes, including 17 glutamatergic and 8 GABAergic neuron subpopulations. Combining evidence from human and mouse tissue-microdissection, neuronal cell isolation and spatial transcriptomics, we show that single-cell expression patterns capture fine-resolution neuronal anatomical topography. By stratifying subjects into early and late pathology groups, we uncover stage-dependent and cell-type specific transcriptional modules altered during AD progression. These include early-stage cell-type specific dysregulation of cellular and cholesterol metabolism, late-stage neuron-glia alterations in neurotransmission, and late-stage signatures of cellular stress, apoptosis, and DNA damage broadly shared across cell types. Late-stage signatures show signs of convergence in hippocampal and cortical cells, while early changes diverge; highlighting the relevance of characterizing molecular pathology across brain regions and AD progression. Finally, we characterize neuron subregion-specific responses to AD pathology and show that CA1 pyramidal neurons are the most transcriptionally altered while CA3 and dentate gyrus granule neurons the least. Our study provides a valuable resource to extend cell type-specific studies of AD to clinically relevant brain regions affected early by pathology in disease progression.

Abstract Cerebrovascular breakdown occurs early in Alzheimer’s Disease (AD), but its cell-type-specific molecular basis remains uncharacterized. Here, we characterize single-cell transcriptomic differences in human cerebrovasculature across 220 AD and 208 control individuals and across 6 brain regions. We annotate 22,514 cerebrovascular cells in 11 subtypes of endothelial, pericyte, smooth muscle, perivascular fibroblast, and ependymal cells, and how they differ in abundance and gene expression between brain regions. We identify 2,676 AD-differential genes, including lower expression of PDGFRB in pericytes, and ABCB1 and ATP10A in endothelial cells. These AD-differential genes reveal common upstream regulators, including MECOM, EP300, and KLF4, whose targeting may help restore vasculature function. We find coordinated vasculature-glial-neuronal co-expressed gene modules supported by ligand-receptor pairs, involved in axon growth/degeneration and neurogenesis, suggesting mechanistic mediators of neurovascular unit dysregulation in AD. Integration with AD genetics reveals 125 AD-differential genes directly linked to AD-associated genetic variants (through vasculature-specific eQTLs, Hi-C, and correlation-based evidence), 559 targeted by AD-associated regulators, and 661 targeted by AD-associated ligand-receptor signaling. Lastly, we show that APOE4-genotype associated differences are significantly enriched among AD-associated genes in capillary and venule endothelial cells, and subsets of pericytes and fibroblasts, which underlie the vascular dysregulation in APOE4-associated cognitive decline. Overall, our multi-region molecular atlas of differential human cerebrovasculature genes and pathways in AD can help guide early-stage AD therapeutics.

Abstract Despite significant advances in identifying genetic drivers of neurodegenerative disorders, the majority of affected individuals lack molecular genetic diagnosis, with somatic mutations proposed as one potential contributor to increased risk. Here, we report the first cell-type-specific map of somatic mosaicism in Alzheimer’s Dementia (AlzD), using 4,014 cells from prefrontal cortex samples of 19 AlzD and 17 non-AlzD individuals. We integrate full-transcript single-nucleus RNA-seq (SMART-Seq) with matched individual-level whole-genome sequencing to jointly infer mutational events and the cell-type in which they occurred. AlzD individuals show increased mutational burden, localized in excitatory neurons, oligodendrocytes, astrocytes and disease-associated “senescent” cells. High-mutational-burden cells showed mutational enrichment and similar single-cell expression profiles in AlzD cases versus non-AlzD individuals, indicating cellular-level genotype-to-phenotype correlation. Somatic mutations are specifically enriched for known AlzD genes, and implicate biologically meaningful cell-type specific processes, including: neuronal energy regulation, endocytic trafficking ( NEFM ), lipid metabolism ( CNP, CRYAB ), proteostasis ( USP34 ), cytoskeleton, and microtubule dynamics ( MACF1 ).

Abstract Alzheimer’s disease is the leading cause of dementia worldwide, but the cellular pathways that underlie its pathological progression across brain regions remain poorly understood 1–3 . Here we report a single-cell transcriptomic atlas of six different brain regions in the aged human brain, covering 1.3 million cells from 283 post-mortem human brain samples across 48 individuals with and without Alzheimer’s disease. We identify 76 cell types, including region-specific subtypes of astrocytes and excitatory neurons and an inhibitory interneuron population unique to the thalamus and distinct from canonical inhibitory subclasses. We identify vulnerable populations of excitatory and inhibitory neurons that are depleted in specific brain regions in Alzheimer’s disease, and provide evidence that the Reelin signalling pathway is involved in modulating the vulnerability of these neurons. We develop a scalable method for discovering gene modules, which we use to identify cell-type-specific and region-specific modules that are altered in Alzheimer’s disease and to annotate transcriptomic differences associated with diverse pathological variables. We identify an astrocyte program that is associated with cognitive resilience to Alzheimer’s disease pathology, tying choline metabolism and polyamine biosynthesis in astrocytes to preserved cognitive function late in life. Together, our study develops a regional atlas of the ageing human brain and provides insights into cellular vulnerability, response and resilience to Alzheimer’s disease pathology.

Abstract Aberrant activity of cyclin-dependent kinase (Cdk5) has been implicated in various neurodegenerative diseases. This effect is mediated by pathological cleavage of the Cdk5 activator p35 to produce the truncated product p25, exhibiting increased stability and altered substrate specificity. The benefit of blocking p25 production has been demonstrated in various rodent and human neurodegenerative models. However, important Cdk5/p35 functions in the developing and adult brain have made it challenging to selectively target the detrimental effects of Cdk5/p25 while sparing the physiological functions of Cdk5/p35. Here, we report a 12-amino acid-long peptide fragment derived from Cdk5 (the Cdk5 inhibitory (Cdk5i) peptide) that shows a high binding affinity toward the Cdk5/p25 complex and can efficiently and selectively inhibit Cdk5/p25 kinase activity. Using cellular assays, mouse neurodegeneration models and human cerebral organoids generated from patient-derived iPSCs, we demonstrate beneficial effects of the Cdk5i peptide on various pathological phenotypes including gliosis, DNA damage, and Tau hyperphosphorylation.