Culture-acquired variants in human pluripotent stem cells (hPSCs) hinder their applications in research and clinic. However, the mechanisms that underpin selection of variants remain unclear. Here, through analysis of comprehensive karyotyping datasets from over 23,000 hPSC cultures of more than 1,500 lines, we explored how culture conditions shape variant selection. Strikingly, we identified an association of chromosome 1q gains with feeder-free cultures and noted a rise in its prevalence in recent years, coinciding with increased usage of feeder-free regimens. Competition experiments of multiple isogenic lines with and without a chromosome 1q gain confirmed that 1q variants have an advantage in feeder-free (E8/vitronectin), but not feeder-based, culture. Mechanistically, we show that overexpression of MDM4, located on chromosome 1q, drives variants' advantage in E8/vitronectin by alleviating genome damage-induced apoptosis, which is lower in feeder-based conditions. Our study explains condition-dependent patterns of hPSC aberrations and offers insights into the mechanisms of variant selection.

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiomyocytes have emerged as powerful tools for disease modelling and cell therapy. The production of cardiomyocytes from hPSCs typically requires expanding large numbers of hPSCs and maintaining them in culture for extended periods of time. This in turn predisposes hPSCs to the acquisition of non-random genetic changes, including recurrent gains of chromosome 1q. Here, we show that gain of chromosome 1q in hPSCs affects both the efficiency of differentiation to cardiomyocytes and phenotype of the differentiated cells. Mechanistically, we show that aberrant activation of the Wnt signalling pathway underpins the skewed differentiation of variant 1q hPSCs. Collectively, our data demonstrates that the presence of genetically variant cells in cultures is a significant concern for production of hPSC-derived cardiomyocytes for research or clinical applications. Further, our results suggest new approaches for removing genetically variant cells for future clinical applications.

Since the first derivation of human pluripotent stem cells (hPSCs), the number of culture conditions has steadily increased, making hPSC culture more facile. Nonetheless, there remains the persistent issue of culture-acquired genetic changes, hampering the reproducibility of hPSC research and jeopardising their clinical use. Here, we utilised comprehensive karyotyping datasets from over 20,000 hPSC cultures sampled under different conditions to ascertain association of genetic changes with specific culture regimens. We found condition-dependent patterns of aberrations, with higher prevalence of chromosome 1q gains in recent years, associated with increased use of contemporary, feeder-free cultures. Mechanistically, we show the context-dependent selection of 1q variants is mainly driven by MDM4, a gene amplified in many cancers, located on chromosome 1q. To facilitate reproducibility of hPSC research and their safe clinical utility, we provide a unique hPSC karyotype resource for informing the risk assessment of genetic aberrations and developing strategies to suppress their occurrence.

Abstract Background Splicing in 3’ untranslated regions (3’ UTRs) is generally considered a signal to elicit transcript degradation via nonsense-mediated decay (NMD) due to the presence of an exon junction complex (EJC) downstream of the stop codon. However, 3’ UTR intron (3UI)-containing transcripts are widespread and highly expressed in both normal tissues and cancers. Results Here we present and characterise a novel transcriptome assembly built from 7897 solid tumour and normal samples from The Cancer Genome Atlas. We identify thousands of 3UI-containing transcript isoforms, many of which are expressed across multiple cancer types. We find that the expression of core NMD component UPF1 negatively correlates with global 3UI splicing between normal samples, however this correlation is lost in colon cancer. We find that 3UIs found exclusively within 3’ UTRs ( bona-fide 3UIs) are not predominantly NMD-sensitising, unlike introns present in 3’ UTRs due to premature termination. We identify HRAS as an example where 3UI splicing rescues the transcript from NMD. Bona-fide , but not premature termination codon (PTC) carrying 3UI-transcripts are spliced more in cancer samples compared to matched normals in the majority of cancer types analysed. In colon cancer, differentially spliced 3UI-containing transcripts are enriched in the canonical Wnt signalling pathway, with CTNNB1 being the most over-spliced in colon cancer compared to normal. We show that manipulating Wnt signalling can further regulate splicing of Wnt component transcript 3’ UTRs. Conclusions Our results indicate that 3’ UTR splicing is not a rare occurrence, especially in colon cancer, where 3’ UTR splicing regulates transcript expression in EJC-dependent and independent manners.