The precise annotation and accurate identification of neural structures are prerequisites for studying mammalian brain function. The orientation of neurons and neural circuits is usually determined by mapping brain images to coarse axial-sampling planar reference atlases. However, individual differences at the cellular level likely lead to position errors and an inability to orient neural projections at single-cell resolution. Here, we present a high-throughput precision imaging method that can acquire a co-localized brain-wide data set of both fluorescent-labelled neurons and counterstained cell bodies at a voxel size of 0.32 × 0.32 × 2.0 μm in 3 days for a single mouse brain. We acquire mouse whole-brain imaging data sets of multiple types of neurons and projections with anatomical annotation at single-neuron resolution. The results show that the simultaneous acquisition of labelled neural structures and cytoarchitecture reference in the same brain greatly facilitates precise tracing of long-range projections and accurate locating of nuclei.

Significance The cholinergic system plays a critical role in neural modulation of the mammalian brain. Here, we generated a comprehensive atlas of the cholinergic system in the mouse brain via the whole-brain imaging and reconstruction system. In the whole-brain dataset, the cholinergic neurons were divided into three categories including cortical VIP neurons, long-range projection neurons, and brainstem motor neurons. After reconstructing the cholinergic neurons in a subregion of basal forebrain, we found that their projections to the forebrain and midbrain showed neuronal subgroups with distinct projection specificity. Our work presents three-dimensional information about the cholinergic system in the mouse brain, facilitating further studies of the cholinergic system.

Abstract Dendritic and axonal morphology reflects the input and output of neurons and is a defining feature of neuronal types 1,2 , yet our knowledge of its diversity remains limited. Here, to systematically examine complete single-neuron morphologies on a brain-wide scale, we established a pipeline encompassing sparse labelling, whole-brain imaging, reconstruction, registration and analysis. We fully reconstructed 1,741 neurons from cortex, claustrum, thalamus, striatum and other brain regions in mice. We identified 11 major projection neuron types with distinct morphological features and corresponding transcriptomic identities. Extensive projectional diversity was found within each of these major types, on the basis of which some types were clustered into more refined subtypes. This diversity follows a set of generalizable principles that govern long-range axonal projections at different levels, including molecular correspondence, divergent or convergent projection, axon termination pattern, regional specificity, topography, and individual cell variability. Although clear concordance with transcriptomic profiles is evident at the level of major projection type, fine-grained morphological diversity often does not readily correlate with transcriptomic subtypes derived from unsupervised clustering, highlighting the need for single-cell cross-modality studies. Overall, our study demonstrates the crucial need for quantitative description of complete single-cell anatomy in cell-type classification, as single-cell morphological diversity reveals a plethora of ways in which different cell types and their individual members may contribute to the configuration and function of their respective circuits.

ABSTRACT We report the generation of a multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex (MOp or M1) as the initial product of the BRAIN Initiative Cell Census Network (BICCN). This was achieved by coordinated large-scale analyses of single-cell transcriptomes, chromatin accessibility, DNA methylomes, spatially resolved single-cell transcriptomes, morphological and electrophysiological properties, and cellular resolution input-output mapping, integrated through cross-modal computational analysis. Together, our results advance the collective knowledge and understanding of brain cell type organization: First, our study reveals a unified molecular genetic landscape of cortical cell types that congruently integrates their transcriptome, open chromatin and DNA methylation maps. Second, cross-species analysis achieves a unified taxonomy of transcriptomic types and their hierarchical organization that are conserved from mouse to marmoset and human. Third, cross-modal analysis provides compelling evidence for the epigenomic, transcriptomic, and gene regulatory basis of neuronal phenotypes such as their physiological and anatomical properties, demonstrating the biological validity and genomic underpinning of neuron types and subtypes. Fourth, in situ single-cell transcriptomics provides a spatially-resolved cell type atlas of the motor cortex. Fifth, integrated transcriptomic, epigenomic and anatomical analyses reveal the correspondence between neural circuits and transcriptomic cell types. We further present an extensive genetic toolset for targeting and fate mapping glutamatergic projection neuron types toward linking their developmental trajectory to their circuit function. Together, our results establish a unified and mechanistic framework of neuronal cell type organization that integrates multi-layered molecular genetic and spatial information with multi-faceted phenotypic properties.

Abstract The midbrain participates in complex neural information processing in the ascending and descending circuits, but their organization remains unclear due to the lack of comprehensive dissection of the characterization of individual neurons. Combining fluorescent micro-optical sectional tomography with sparse labeling, we acquired the whole-brain dataset with high resolution and reconstructed the detailed morphology of the pontine-tegmental cholinergic neurons (PTCNs). As the main cholinergic system of the midbrain, the individual PTCNs own abundant axons with length up to 60 cm and 5000 terminal branches and innervate multiple brain regions from the spinal cord to cortex in both hemispheres. According to various targeting regions in the ascending and descending circuits, individual PTCNs could be grouped into four types and the axonal fibers of cholinergic neurons in the pedunculopontine nucleus present more divergent while neurons in the laterodorsal tegmental nucleus contain richer axonal fibers and dendrites. In the axonal targeting nuclei, such as in the thalamus or cortex, the individual neurons innervate multiple sub-regions with separate pathways. These results provide the detailed organization characterization of the cholinergic neurons to understand the connection logic of the midbrain.

Abstract The dorsal raphe nucleus (DR) and median raphe nucleus (MR) contain populations of glutamatergic and GABAergic neurons regulating diverse behavioral functions. Their whole-brain input-output circuits remain incompletely understood. We used viral tracing combined with fluorescence micro-optical sectioning tomography to generate a comprehensive whole-brain atlas of inputs and outputs of glutamatergic and GABAergic neurons in the DR and MR. We discovered that these neurons receive inputs from similar upstream brain regions. The glutamatergic and GABAergic neurons in the same raphe nucleus have divergent projection patterns with differences in critical brain regions. Specifically, MR glutamatergic neurons project to the lateral habenula via multiple pathways. Correlation and cluster analysis indicated that glutamatergic and GABAergic neurons in the same raphe nucleus receive inputs from heterogeneous neurons in upstream brain regions and send different collateral projections. This connectivity atlas provides insights into the cell heterogeneity, anatomical connectivity and behavioral functions of the raphe nucleus.

ABSTRACT Endogenous opioid antinociception is a self-regulatory mechanism that reduces chronic pain, but its underlying circuit mechanism remains largely unknown. Here, we showed that endogenous opioid antinociception required the activation of mu-opioid receptors (MORs) in GABAergic neurons of the central amygdala nucleus (CEA) in a persistent-hyperalgesia mouse model. Pharmacogenetic suppression of these CEAMOR neurons, which mimics the effect of MOR activation, alleviated the persistent hyperalgesia. Furthermore, single-neuron projection analysis revealed multiple projectome-based subtypes of CEAMOR neurons, each innervating distinct target brain regions. We found that the suppression of axon branches projecting to the parabrachial nucleus (PB) of one subtype of CEAMOR neurons alleviated persistent hyperalgesia, indicating a subtype- and axonal-branch-specific mechanism of action. Further electrophysiological analysis revealed that suppression of a distinct CEA-PB disinhibitory circuit controlled endogenous opioid antinociception. Thus, this study identified the central neural circuit that underlies endogenous opioid antinociception, providing new insight into the endogenous pain modulatory mechanisms.

The swelling/shrinking behavior is a complex process of interactions between multiscale structures, and it is also a major problem affecting the processing and utilization of bamboo. As an important structure connecting macroscopic and cellular scales in bamboo, the analysis of vascular bundles' swelling/shrinking behaviors is important for revealing the swelling/shrinking laws of bamboo. In this study, in-situ observation technique was used to characterize the swelling/shrinking behaviors of open vascular bundles, open fibers, semi-open vascular bundles and semi-open fibers, and further analyzed the area change and location change of open vascular bundles (OV) and its fibers (OF), semi-open vascular bundles (HOV) and its fibers (HOF), and then analyzed the area and position change. During the swelling/shrinking cycle, the area change patterns of HOV was similar. The shrinkage rate of OV varied little, with a range of 1–0.74 %. The shrinkage rate of HOV was 1–0.18 %. The shrinkage ranges for OF and HOF fibers were closer, 1–0.2 % and 1–0.18 %, respectively. Swelling/shrinking was accompanied by movement of vascular bundles and fiber, with HOV moving in a radial direction and OV moving in a definite direction. Random forest simulations reveal that the effect of different fiber sheaths on the shrinkage area of the vascular bundle varies, and the HOV is more affected by the fiber sheath,its factor importance is 0.47. The importance of the fibrous sheath "a" to the OV area is only 0.24. This provides an important reference for the subsequent establishment of multiscale swelling/shrinking relationships for bamboo.

In multicolor fluorescence microscopy, it is crucial to orient biological structures at a single-cell resolution based on precise anatomical annotations of cytoarchitecture images. However, during synchronous multicolor imaging, due to spectral mixing, the crosstalk from the blue signals of 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained cytoarchitecture images to the green waveband hinders the visualization and identification of green signals. Here, we proposed a deep learning-based framework named the crosstalk elimination and cytoarchitecture enhancement pipeline (CECEP) to simultaneously acquire crosstalk-free signals in the green channel and high-contrast DAPI-stained cytoarchitecture images during multicolor fluorescence imaging. For the CECEP network, we proposed an unsupervised learning algorithm named the cytoarchitecture enhancement network (CENet), which increased the signal-to-background ratio (SBR) of the cytoarchitecture images from 1.5 to 15.0 at a reconstruction speed of 25 Hz for 1800 × 1800 pixel images. The CECEP network is widely applicable to images of different quality, different types of tissues, and different multicolor fluorescence microscopy. In addition, the CECEP network can also facilitate various downstream analysis tasks, such as cell recognition, structure tensor calculation, and brain region segmentation. With the CECEP network, we simultaneously acquired two specific fluorescence-labeled neuronal distributions and their colocated high-SBR cytoarchitecture images without crosstalk throughout the brain. Experimental results demonstrate that our method could potentially facilitate multicolor fluorescence imaging applications in biology, such as revealing and visualizing different types of biological structures with precise locations and orientations.