ABSTRACT Connectomes of human cortical gray matter require high-contrast homogeneously stained samples sized at least 2-3 mm on a side, and a whole-mouse brain connectome requires samples sized at least 5-10 mm on a side. Here we report en-bloc staining and embedding protocols for these and other applications, removing a key obstacle for connectomic analyses at mammalian whole-brain level.

Abstract The molecular mechanisms underlying the recognition of epitopes by T cell receptors (TCRs) are critical for activating T cell immune responses and rationally designing TCR-based therapeutics. Single-cell sequencing techniques vastly boost the accumulation of TCR sequences, while the limitation of available TCR-pMHC structures hampers further investigations. In this study, we proposed a comprehensive strategy that incorporates structural information and single-cell sequencing data to investigate the epitope-recognition mechanisms of TCRs. By antigen specificity clustering, we mapped the epitope sequences between epitope-known and epitope-unknown TCRs from COVID-19 patients. One reported SARS-CoV-2 epitope, NQKLIANQF (S 919-927 ), was identified for a TCR expressed by 614 T cells (TCR-614). Epitope screening also identified a potential cross-reactive epitope, KLKTLVATA (NSP3 1790-1798 ), for a TCR expressed by 204 T cells (TCR-204). According to the molecular dynamics (MD) simulations, we revealed the detailed epitope-recognition mechanisms for both TCRs. The structural motifs responsible for epitope recognition revealed by the MD simulations are consistent with the sequential features recognized by the sequence-based clustering method. This strategy will facilitate the discovery and optimization of TCR-based therapeutics. In addition, the comprehensive strategy can also promote the development of cancer vaccines in virtue of the ability to discover neoepitopes and epitope-recognition mechanisms.

Serotonin (5-HT) is a phylogenetically conserved monoamine neurotransmitter modulating a variety of processes in the brain. To directly visualize the dynamics of 5-HT, we developed a genetically encoded GPCR-Activation-Based 5-HT (GRAB5-HT) sensor with high sensitivity, selectivity, and spatiotemporal resolution. GRAB5-HT, detected 5-HT release in multiple physiological and pathological conditions in both flies and mice, and thus provides new insights into the dynamics and mechanisms of 5-HT signaling.

Abstract The purinergic signaling molecule adenosine (Ado) modulates many physiological and pathological brain functions,but its spatiotemporal release dynamics in the brain remains largely unknown. We developed a genetically encoded G PC R - A ctivation– B ased Ado sensor (GRAB Ado ) in which Ado-induced changes in the human A 2A receptor are reflected by fluorescence increases. This GRAB Ado revealed that neuronal activity-induced extracellular Ado elevation was due to direct Ado release from somatodendritic regions of the neuron, requiring calcium influx through L-type calcium channels, rather than the degradation of extracellular ATP. The Ado release was slow (∼30 s) and depended on equilibrative nucleoside transporters (ENTs) rather than conventional vesicular release mechanisms. Thus, GRAB Ado reveals an activity-dependent slow Ado release from somatodendritic region of the neuron, potentially serving modulating functions as a retrograde signal.

Although DNA is increasingly being adopted as a generalizable medium for information storage and transfer, reliable methods for ensuring information security remain to be addressed. In this study, we developed and validated a cryptographic encoding scheme, Genomic Sequence Encryption (GSE), to address the challenge of information confidentiality and integrity in biological substrates. GSE enables genomic information encoding that is readable only with a cryptographic key. We show that GSE can be used for cell signatures that enable the recipient of a cell line to authenticate its origin and validate if the cell line has been modified in the interim. We implement GSE through multi-site base editing and encode information through editing across >100 genomic sites in mammalian cells. We further present an enrichment step to obtain individual stem cells with more than two dozen edits across a single genome with minimal screening. This capability can be used to introduce encrypted signatures in living animals. As an encryption scheme, GSE is falsification-proof and enables secure information transfer in biological substrates.