A key aspect of nearly all single-cell sequencing experiments is dissociation of intact tissues into single-cell suspensions. While many protocols have been optimized for optimal cell yield, they have often overlooked the effects that dissociation can have on ex vivo gene expression. Here, we demonstrate that use of enzymatic dissociation on brain tissue induces an aberrant ex vivo gene expression signature, most prominently in microglia, which is prevalent in published literature and can substantially confound downstream analyses. To address this issue, we present a rigorously validated protocol that preserves both in vivo transcriptional profiles and cell-type diversity and yield across tissue types and species. We also identify a similar signature in postmortem human brain single-nucleus RNA-sequencing datasets, and show that this signature is induced in freshly isolated human tissue by exposure to elevated temperatures ex vivo. Together, our results provide a methodological solution for preventing artifactual gene expression changes during fresh tissue digestion and a reference for future deeper analysis of the potential confounding states present in postmortem human samples.

Abstract Microglia, the tissue resident macrophages of the CNS, are implicated in a broad range of neurological pathologies, from acute brain injury to dementia. Here, we profiled gene expression variation in primary human microglia isolated from 141 patients undergoing neurosurgery. Using single cell and bulk RNA sequencing, we defined distinct cellular populations of acutely in vivo -activated microglia, and characterised a dramatic switch in microglial population composition in patients suffering from acute brain injury. We mapped expression quantitative trait loci (eQTLs) in human microglia and show that many disease-associated eQTLs in microglia replicate well in a human induced pluripotent stem cell (hIPSC) derived macrophage model system. Using ATAC-seq from 95 individuals in this hIPSC model we fine-map candidate causal variants at risk loci for Alzheimer’s disease, the most prevalent neurodegenerative condition in acute brain injury patients. Our study provides the first population-scale transcriptional map of a critically important cell for neurodegenerative disorders.

Abstract Glioblastoma multiforme (GBM), is the most common and the most aggressive type of primary brain malignancy. Glioblastoma stem- like cells (GSCs) are able to migrate in vascular niches within or away from the tumour mass, increasing tumour resistance to patient treatments and contributing to relapses. To study individual GSCs migration and their interactions with the microenvironment in the vasculature, there is a need to develop a model of human blood vessels in vitro . Herein, we report a systematic study on the interaction between patient-derived glioma stem- like cell lines with different organotypic perivascular niche models. A microfluidic chip integrated with an extracellular matrix was fabricated to support the culture of rounded microvessels, formed with endothelial cells from three different organs, (1) human brain microvascular endothelial cells (hCMEC/D3), (2) human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and, (3) human lung microvascular endothelial cells (HMVEC-L). Three-dimensional (3D) cell culture retains selected adherent and tight junction markers of the endothelial cells, and the stemness-related genes of GSCs. We optimized the experimental protocol to perform qPCR, and western blot on the co-cultured GSCs with endothelial cells forming microvessels. Endpoint biological assays showed upregulation of neovascularization-related genes in endothelial cells (e.g., angiopoietins, vascular endothelial growth factor receptors) resulted after their co-culture with GBM cells. Moreover, we measured cancer cell speed and polarization during migration towards the endothelial cell formed vessel by live-cell imaging showing that organotypic (brain cancer cells – brain endothelial microvessel) interactions differ from those within non-tissue specific vascular niches. The development and optimization of this 3D microfluidic device could provide the next level of complexity of an in vitro system to study the influence of glioma cells on normal brain endothelium. More importantly, it enables the possibility to conduct comparative studies to dissect the influence of 3D culture, microvessel architecture and organotypic vessel types on glioma cells’ stemness and migration.

Abstract A key aspect of nearly all single cell experiments is the necessity to dissociate intact tissues into single cell suspensions for processing. While many protocols have been optimized for optimal cell yield, they have often overlooked the effects that dissociation can have on ex vivo gene expression changes during this process. Microglia, the brain’s resident macrophages, are a highly dynamic population that are extremely sensitive to their microenvironment and have been shown to dramatically alter their transcriptome upon stimulation. We demonstrate that use of enzymatic dissociation methods on mouse central nervous system (CNS) tissue induces an aberrant gene expression signature in microglia that can significantly confound downstream analysis. To minimize this issue, we developed a flexible protocol, that can be used with existing enzymatic protocols for fresh tissue, to eliminate artifactual gene expression while allowing for increased cell type diversity and yield. We demonstrate efficacy of this protocol in analysis of diverse CNS cell types and sorted myeloid populations while using enzymatic dissociation. Generation of new and reanalysis of previously published human brain single nucleus RNAseq (snRNA-seq) datasets reveal that a similar signature is also present in post-mortem tissue. Through novel snRNA-seq analysis of acutely-resected neurosurgical tissue we demonstrate that this signature can be induced in human tissue due to technical differences in sample processing. These results provide key insight into the potential confounds of enzymatic digestion and provide a solution to allow for enzymatic digestion for scRNA-seq while avoiding ex vivo transcriptional artifacts. Analysis of human tissue reveals potential for artifacts in current and future snRNA-seq datasets that will require deeper analysis and careful consideration to separate true biology from artifacts related to post-mortem processes.

Summary The molecular mechanisms controlling the balance of quiescence and proliferation in adult neural stem cells (NSCs) are often deregulated in brain cancers such as glioblastoma (GBM). Previously, we reported that FOXG1, a forebrain-restricted neurodevelopmental transcription factor, is frequently upregulated in glioblastoma stem cells (GSCs) and limits the effects of cytostatic pathways, in part by repression of the tumour suppressor Foxo3 . Here, we show that increased FOXG1 upregulates FoxO6 , a more recently discovered FoxO family member with potential oncogenic functions. Although genetic ablation of FoxO6 in proliferating NSCs has no effect on the cell cycle or entry into quiescence, we find that FoxO6 -null NSCs can no longer efficiently exit quiescence following FOXG1 elevation. Increased FoxO6 results in the formation of large acidic vacuoles, reminiscent of Pak1-regulated macropinocytosis. Consistently, Pak1 expression is upregulated by FOXG1 overexpression and downregulated upon FoxO6 loss in proliferative NSCs. These data suggest a pro-oncogenic role for FoxO6 in controlling the exit from quiescence in NSCs, and shed light on the functions of this underexplored FoxO family member. Research highlights FoxO6 is a downstream effector of elevated FOXG1 in mouse NSCs and GSCs. Upregulation of FoxO6 is necessary for FOXG1 to drive efficient quiescence exit of NSCs. FoxO6 overexpression stimulates macropinocytosis, a process regulated by the actin cytoskeleton regulator Pak1. Pak1 is upregulated by FOXG1 overexpression and downregulated upon FoxO6 loss.