Abstract The assembly of intracellular proteins into biomolecular condensates is a fundamental process underlying the organisation of intracellular space and the regulation of many cellular processes. Mapping and characterising phase behaviour of biomolecules is essential to understand the mechanisms of condensate assembly, and to develop therapeutic strategies targeting biomolecular condensate systems. A central concept for characterising phase-separating systems is the phase diagram. Phase diagrams are typically built from numerous individual measurements sampling different parts of the parameter space. However, even when performed in microwell plate format, this process is slow, low throughput and requires significant sample consumption. To address this challenge, we present here a combinatorial droplet microfluidic platform, termed PhaseScan, for rapid and high-resolution acquisition of multidimensional biomolecular phase diagrams. Using this platform, we characterise the phase behaviour of a wide range of systems under a variety of conditions and demonstrate that this approach allows the quantitative characterisation of the effect of small molecules on biomolecular phase transitions.

Abstract RNA viruses induce formation of subcellular organelles that provide microenvironments conducive to their replication. Here we show that replication factories of rotaviruses represent protein-RNA condensates that are formed via liquid-liquid phase separation. We demonstrate that rotavirus proteins NSP5 and NSP2 undergo phase separation in vitro and form RNA-rich condensates in vivo that can be reversibly dissolved by aliphatic diols. During infection, these RNA-protein condensates became less dynamic and impervious to aliphatic diols, indicating a transition from a liquid to solid state. Some aspects of assembly of rotavirus replication factories mirror the formation of cytoplasmic ribonucleoprotein granules, while the selective enrichment of viral transcripts appears to be a unique feature of these condensates. Such complex RNA-protein condensates that underlie replication of RNA viruses represent an attractive target for developing novel therapeutic approaches.

Abstract Intracellular phase separation of proteins into biomolecular condensates is increasingly recognised as an important phenomenon for cellular compartmentalisation and regulation of biological function. Different hypotheses about the parameters that determine the tendency of proteins to form condensates have been proposed with some of them probed experimentally through the use of constructs generated by sequence alterations. To broaden the scope of these observations, here, we established an in silico strategy for understanding on a global level the associations between protein sequence and condensate formation, and used this information to construct machine learning classifiers for predicting liquid–liquid phase separation (LLPS) from protein sequence. Our analysis highlighted that LLPS–prone sequences are more disordered, hydrophobic and of lower Shannon entropy than sequences in the Protein Data Bank or the Swiss-Prot database, and have their disordered regions enriched in polar, aromatic and charged residues. Using these determining features together with neural network based word2vec sequence embeddings, we developed machine learning classifiers for predicting protein condensate formation. Our model, trained to distinguish LLPS-prone sequences from structured proteins, achieved high accuracy (93%; 25-fold cross-validation) and identified condensate forming sequences from external independent test data at 97% sensitivity. Moreover, in combination with a classifier that had developed a nuanced insight into the features governing protein phase behaviour by learning to distinguish between sequences of varying LLPS propensity, the sensitivity was supplemented with high specificity (approximated ROC–AUC of 0.85). These results provide a platform rooted in molecular principles for understanding protein phase behaviour. The predictor is accessible from https://deephase.ch.cam.ac.uk/ . Significance Statement The tendency of many cellular proteins to form protein-rich biomolecular condensates underlies the formation of subcellular compartments and has been linked to various physiological functions. Understanding the molecular basis of this fundamental process and predicting protein phase behaviour have therefore become important objectives. To develop a global understanding of how protein sequence determines its phase behaviour, here, we constructed bespoke datasets of proteins of varying phase separation propensity and identified explicit biophysical and sequence-specific features common to phase separating proteins. Moreover, by combining this insight with neural network based sequence embeddings, we trained machine learning classifiers that identified phase separating sequences with high accuracy, including from independent external test data. The predictor is available from https://deephase.ch.cam.ac.uk/ .

Abstract The protein high mobility group A1 (HMGA1) is an important regulator of chromatin organization and function. However, the mechanisms by which it exerts its biological function are not fully understood. Here, we report that the HMGA isoform, HMGA1a, nucleates into foci that display liquid-like properties in the nucleus, and that the protein readily undergoes phase separation to form liquid condensates in vitro. By bringing together machine-leaning modelling, cellular and biophysical experiments and multiscale simulations, we demonstrate that phase separation of HMGA1a is critically promoted by protein–DNA interactions, and has the potential to be modulated by post-transcriptional effects such as phosphorylation. We further show that the intrinsically disordered C-terminal tail of HMGA1a significantly contributes to its phase separation through cation–π and electrostatic interactions. Our work sheds light on HMGA1 phase separation as an emergent biophysical factor in regulating chromatin structure.

Protein-based biologics are highly suitable for drug development, as they exhibit low toxicity and high specificity for their targets. However, for therapeutic applications, biologics must often be formulated to very high concentrations, making insufficient solubility a critical bottleneck in drug development pipelines. Here, we report an ultra-high-throughput microfluidic platform for protein solubility screening. In comparison with previous methods, this microfluidic platform can make, incubate, and measure samples in a few minutes, uses just 20 micrograms of protein (> 10-fold improvement) and yields 10,000 data points (1000-fold improvement). This allows quantitative comparison of formulation additives, such as salt, polysorbate, histidine, arginine and sucrose. Additionally, we can measure how solubility is affected by different concentrations of multiple additives, find a suitable pH for the formulation, and measure the impact of single mutations on solubility, thus enabling the screening of large libraries. By reducing material and time costs, this approach makes detailed multi-dimensional solubility optimization experiments possible, streamlining drug development and increasing our understanding of biotherapeutic solubility and the effects of excipients.

Abstract Liquid proteinaceous materials have been frequently found in cells or tissues and are crucial for various biological processes. Unlike their solid-state counterparts, liquid-state protein compartments are challenging to engineer and control at the microscale. Conventionally, gelation (sol-gel transition) of biological molecules has been thought to be the intermediate step between liquid-liquid phase separation (LLPS) states and insoluble aggregates that are related to protein functions, malfunctions and even diseases. However, the opposite process, i.e., the gel-sol transition of materials, has not been broadly explored. Here we describe a thermoresponsive gel-sol transition of a protein in a crowded environment that results in a demixed LLPS state, contradicting the common consequence of a one-phase protein solution by the end of such transition at elevated temperature without crowding agents. We also demonstrate a simple method to monitor the gel-sol transition by showing that elongated gelatin microgels can evolve towards a spherical morphology in the crowding agents because of interfacial tension. The LLPS system was explored for the diffusion of small particles for drug-release application scenarios. Our results demonstrate a route for the rapid construction of LLPS models, where the gel-sol transition of the protein-rich phase is monitorable. The models are featured with tunable size and dimensional monodispersity of dispersed condensates. The present study can be employed in biophysics and bioengineering with practices such as 3D printing and temperature sensing.