Fluorescent calcium indicator proteins, such as GCaMP3, allow imaging of activity in genetically defined neuronal populations. GCaMP3 can be expressed using various gene delivery methods, such as viral infection or electroporation. However, these methods are invasive and provide inhomogeneous and nonstationary expression. Here, we developed a genetic reporter mouse, Ai38, which expresses GCaMP3 in a Cre-dependent manner from the ROSA26 locus, driven by a strong CAG promoter. Crossing Ai38 with appropriate Cre mice produced robust GCaMP3 expression in defined cell populations in the retina, cortex, and cerebellum. In the primary visual cortex, visually evoked GCaMP3 signals showed normal orientation and direction selectivity. GCaMP3 signals were rapid, compared with virally expressed GCaMP3 and synthetic calcium indicators. In the retina, Ai38 allowed imaging spontaneous calcium waves in starburst amacrine cells during development, and light-evoked responses in ganglion cells in adult tissue. Our results show that the Ai38 reporter mouse provides a flexible method for targeted expression of GCaMP3.

Abstract Deep learning based animal pose estimation tools have greatly improved animal behaviour quantification. However, those tools all make predictions on individual video frames and do not account for variability of animal body shape in their model designs. Here, we introduce the first video-based animal pose estimation architecture, referred to as OptiFlex, which integrates a flexible base model to account for variability in animal body shape with an optical flow model to incorporate temporal context from nearby video frames. This approach can be combined with multi-view information, generating prediction enhancement using all four dimensions (3D space and time). To evaluate OptiFlex, we adopted datasets of four different lab animal species (mouse, fruit fly, zebrafish, and monkey) and proposed a more intuitive evaluation metric - percentage of correct key points (aPCK). Our evaluations show that OptiFlex provides the best prediction accuracy amongst current deep learning based tools, and that it can be readily applied to analyse a wide range of behaviours.

Abstract The cerebellum is involved in cognition next to motor coordination. During complex tasks, climbing fiber input to the cerebellum can deliver seemingly opposite signals, covering both motor and non-motor functions. To elucidate this ambiguity, we hypothesized that climbing fiber activity represents the saliency of inputs leading to action-readiness. We addressed this hypothesis by recording Purkinje cell activity in lateral cerebellum of awake mice learning go/no-go decisions based on entrained saliency of different sensory stimuli. As training progressed, the timing of climbing fiber signals switched in a coordinated fashion with that of Purkinje cell simple spikes towards the moment of occurrence of the salient stimulus that required action. Trial-by-trial analysis indicated that emerging climbing fiber activity is not linked to individual motor responses or rewards per se, but rather reflects the saliency of a particular sensory stimulus that engages a general readiness to act, bridging the non-motor with the motor functions. In brief Mice were trained to identify the saliency of different sensory inputs in that they had to learn to ignore a prominent sound cue and respond to a light tactile cue in a Go/No-Go licking task. As the mice learned to discriminate the two inputs and respond to the proper signal, the Purkinje cells in the lateral cerebellum switched their climbing fiber activity (i.e., complex spike activity) towards the moment of occurrence of the salient stimulus that required a response, while concomitantly shifting the phase of their simple spike modulation. Trial-by-trial analysis indicates that the emerging climbing fiber activity is not linked to the occurrence of the motor response or reward per se, but rather reflects the saliency of a particular sensory stimulus engaging a general readiness to act.

Miniaturized fluorescence microscopes (miniscopes) have been instrumental to monitor neural activity during unrestrained behavior and their open-source versions have helped to distribute them at an affordable cost. Generally, the footprint and weight of open-source miniscopes is sacrificed for added functionality. Here, we present NINscope: a light-weight, small footprint, open-source miniscope that incorporates a high-sensitivity image sensor, an inertial measurement unit (IMU), and an LED driver for an external optogenetic probe. We highlight the advantages of NINscope by performing the first simultaneous cellular resolution (dual scope) recordings from cerebellum and cerebral cortex in unrestrained mice, revealing that the activity of both regions generally precedes the onset of behavioral acceleration. We further demonstrate the optogenetic stimulation capabilities of NINscope and show that cerebral cortical activity can be driven strongly by cerebellar stimulation. To validate the performance of our miniscope to image from deep-brain regions, we recorded in the dorsal striatum and, using the IMU to assess turning movements, replicate previous studies that show encoding of action space in this subcortical region. Finally, we combine optogenetic stimulation of distinct cortical regions projecting to the dorsal striatum, to probe functional connectivity. In combination with cross-platform control software, NINscope is a versatile addition to the expanding toolbox of open-source miniscopes and will aid multi-region circuit investigations during unrestrained behavior.

Abstract The inferior olive provides the climbing fibers to Purkinje cells in the cerebellar cortex, where they elicit all-or-none complex spikes and control major forms of plasticity. Given their important role in both short-term and long-term coordination of cerebellum-dependent behaviors, it is paramount to understand the factors that determine the output of olivary neurons. Here, we investigate how the inhibitory and excitatory inputs to the olivary neurons interact with each other, generating spiking patterns of olivary neurons that ride on their intrinsic oscillations. Using dual color optogenetic stimulation and whole cell recordings we demonstrate how intervals between the inhibitory input from the cerebellar nuclei and excitatory input from the mesodiencephalic junction affect phase and gain of the olivary output at both the sub- and suprathreshold level. When the excitatory input is activated approximately 50 ms after the inhibitory input, the phase of the intrinsic oscillations becomes remarkably unstable and the excitatory input can hardly generate any olivary spike. Instead, when the excitatory input is activated approximately 150 ms after the inhibitory input, the excitatory input can optimally drive olivary spiking, riding on top of the first cycle of the subthreshold oscillations that have been powerfully reset by the preceding inhibitory input. Simulations of a large-scale network model of the inferior olive highlight to what extent the synaptic interactions penetrate in the neuropil, generating quasi-oscillatory spiking patterns in large parts of the olivary subnuclei, the size of which also depends on the relative timing of the inhibitory and excitatory inputs.

Cerebellar Purkinje cells integrate sensory information with motor efference copies to adapt movements to behavioural and environmental requirements. They produce complex spikes that are triggered by the activity of climbing fibres originating in neurons of the inferior olive. These complex spikes can shape the onset, amplitude and direction of movements as well as the adaptation of such movements to sensory feedback. Clusters of nearby inferior olive neurons project to parasagittally aligned stripes of Purkinje cells, referred to as 'microzones'. It is currently unclear to what extent individual Purkinje cells within a single microzone integrate climbing fibre inputs from multiple sources of different sensory origins, and to what extent sensory-evoked climbing fibre responses depend on the strength and recent history of activation. Here we imaged complex spike responses in cerebellar lobule crus 1 to various types of sensory stimulation in awake mice. We find that different sensory modalities and receptive fields have a mild, but consistent, tendency to converge on individual Purkinje cells. Purkinje cells encoding the same stimulus show increased events with coherent complex spike firing and tend to lie close together. Moreover, whereas complex spike firing is only mildly affected by variations in stimulus strength, it strongly depends on the recent history of climbing fibre activity. Our data point towards a mechanism in the olivo-cerebellar system that regulates complex spike firing during mono- or multisensory stimulation around a relatively low set-point, highlighting an integrative coding scheme of complex spike firing under homeostatic control.

The ability to adapt while exploring the world is critical for survival, yet how it comes about is unclear. Here we show that a whisker protraction reflex can be elicited following rostro-caudal pad stimulation, and that short-term kinematics of this reflex are enhanced when coherent complex spike activity of cerebellar Purkinje cells occurs in crus 1. Instead, the long-term kinematics can be adapted by tetanic stimulation and this adaptation is largely controlled by changes in the simple spike activity of Purkinje cells in crus 2. Increases in whisker protraction correlate with preceding increases in simple spikes in trial-by-trial variation analysis, and both behavioral and spike adaptation are absent in independent mouse models in which postsynaptic long-term potentiation of Purkinje cells is blocked. These differentially distributed short-term and long-term cerebellum-dependent modulations of whisker movements may come into play during coordination and adaptation of natural behaviors like gap crossing and prey capture.

Abstract The cerebellum is important for motor performance and adaptation as well as cognition. Sleep is essential for optimizing of all these functions, but it remains to be elucidated how sleep affects cerebellar processing. It has been suggested that sleep periods with muscle twitches entrain the cerebellum with a copy of motor commands and subsequent sensory feedback signals, to develop predictive coding of movements. If this hypothesis is correct, one expects phasic correlations between the muscle twitches and specific features of the electro-encephalography (EEG) recordings in the cerebellum during various sleep stages as well as the climbing fiber activity in the cerebellar cortex, the modulation of which is relayed from the cerebral cortex via mesodiencephalic junction and inferior olive. Here we provide evidence for coherent correlations between cerebellar and cerebral cortical sleep spindles, twitches as well as patterns of climbing fiber activity. Our data are compatible with the novel concept that muscle twitches evoke complex spike synchronicity during NREM, which in turn affects cerebellar spindle activity and cerebellar-cortical information flow, thereby entraining an internal forward model.