Abstract The signaling molecule auxin controls plant development through a well-known transcriptional mechanism that regulates many genes. However, auxin also triggers cellular responses within seconds or minutes, and mechanisms mediating such fast responses have remained elusive. Here, we identified an ultrafast auxin-mediated protein phosphorylation response in Arabidopsis roots that is largely independent of the canonical TIR1/AFB receptors. Among targets of this novel response are Myosin XI and its adaptor protein MadB2. We show that their auxin-mediated phosphorylation regulates trafficking and polar, subcellular distribution of PIN auxin transporters. This phosphorylation-based auxin signaling module is indispensable during developmental processes that rely on auxin-mediated PIN repolarization, such as termination of shoot gravitropic bending or vasculature formation and regeneration. Hence, we identified a fast, non-canonical auxin response targeting multiple cellular processes and revealed auxin-triggered phosphorylation of a myosin complex as the mechanism for feedback regulation of directional auxin transport, a central component of auxin canalization, which underlies self-organizing plant development.

SUMMARY The plant signaling molecule auxin triggers both fast and slow cellular responses across the plant kingdom, including both land plants and algae. A nuclear response pathway mediates auxin-dependent gene expression, and controls a range of growth and developmental processes in land plants. It is unknown what mechanisms underlie both the physiological responses occurring within seconds, and the responses in algae, that lack the nuclear auxin response pathway. We discovered an ultra-fast proteome-wide phosphorylation response to auxin across 5 land plant and algal species, converging on a core group of shared target proteins. We find conserved rapid physiological responses to auxin in the same species and identified a RAF-like protein kinase as a central mediator of auxin-triggered phosphorylation across species. Genetic analysis allowed to connect this kinase to both auxin-triggered protein phosphorylation and a rapid cellular response, thus identifying an ancient mechanism for fast auxin responses in the green lineage.

SUMMARY The plant signaling molecule auxin controls growth and development through a simple nuclear pathway that regulates gene expresion. There are however several cellular and physiological responses to auxin that occur within seconds, far too rapid to be mediated by transcriptional changes, for which no molecular mechanism has yet been identified. Using a phosphoproteomic strategy in Arabidopsis thaliana roots, we identify an ultra-rapid auxin response system that targets over 1700 proteins, many within 30 seconds. Auxin response is chemically specific, requires known auxin-binding proteins, and targets various pathways. Through exploring its temporal dynamics, we infer auxin-triggered kinase-substrate networks and identify apoplastic pH changes as a target of signaling and as part of a relay mechanism. By generating a variety of phosphoproteomic datasets, integrated with structural information in a web-app, and by demonstrating analysis and inference strategies, we offer a resource to explore rapid and dynamic signaling in plants.

Plants have evolved mechanisms to abscise organs as they develop or when exposed to unfavorable conditions.1Sawicki M. Aït Barka E. Clément C. Vaillant-Gaveau N. Jacquard C. Cross-talk between environmental stresses and plant metabolism during reproductive organ abscission.J. Exp. Bot. 2015; 66: 1707-1719https://doi.org/10.1093/jxb/eru533Crossref Scopus (109) Google Scholar Uncontrolled abscission of petals, fruits, or leaves can impair agricultural productivity.2Funatsuki H. Suzuki M. Hirose A. Inaba H. Yamada T. Hajika M. Komatsu K. Katayama T. Sayama T. Ishimoto M. Fujino K. Molecular basis of a shattering resistance boosting global dissemination of soybean.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111: 17797-17802https://doi.org/10.1073/pnas.1417282111Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar,3Arseneault M.H. Cline J.A. A review of apple preharvest fruit drop and practices for horticultural management.Sci. Hortic. 2016; 211: 40-52https://doi.org/10.1016/j.scienta.2016.08.002Crossref Scopus (50) Google Scholar,4Reichardt S. Piepho H.P. Stintzi A. Schaller A. Peptide signaling for drought-induced tomato flower drop.Science. 2020; 367: 1482-1485https://doi.org/10.1126/science.aaz5641Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar,5Goto K. Yabuta S. Tamaru S. Ssenyonga P. Emanuel B. Katsuhama N. Sakagami J.-I. Root hypoxia causes oxidative damage on photosynthetic apparatus and interacts with light stress to trigger abscission of lower position leaves in Capsicum.Sci. Hortic. 2022; 305111337https://doi.org/10.1016/j.scienta.2022.111337Crossref Scopus (4) Google Scholar Despite its importance for abscission progression, our understanding of the IDA signaling pathway and its regulation remains incomplete. IDA is secreted to the apoplast, where it is perceived by the receptors HAESA (HAE) and HAESA-LIKE2 (HSL2) and somatic embryogenesis receptor kinase (SERK) co-receptors.6Jinn T.L. Stone J.M. Walker J.C. HAESA, an Arabidopsis leucine-rich repeat receptor kinase, controls floral organ abscission.Genes Dev. 2000; 14: 108-117https://doi.org/10.1101/gad.14.1.108Crossref PubMed Google Scholar,7Stenvik G.-E. Tandstad N.M. Guo Y. Shi C.-L. Kristiansen W. Holmgren A. Clark S.E. Aalen R.B. Butenko M.A. The EPIP peptide of INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION is sufficient to induce abscission in Arabidopsis through the receptor-like kinases HAESA and HAESA-LIKE2.Plant Cell. 2008; 20: 1805-1817https://doi.org/10.1105/tpc.108.059139Crossref PubMed Scopus (236) Google Scholar,8Santiago J. Brandt B. Wildhagen M. Hohmann U. Hothorn L.A. Butenko M.A. Hothorn M. Mechanistic insight into a peptide hormone signaling complex mediating floral organ abscission.eLife. 2016; 5e15075https://doi.org/10.7554/eLife.15075Crossref Scopus (165) Google Scholar,9Butenko M.A. Patterson S.E. Grini P.E. Stenvik G.E. Amundsen S.S. Mandal A. Aalen R.B. Inflorescence deficient in abscission controls floral organ abscission in Arabidopsis and identifies a novel family of putative ligands in plants.Plant Cell. 2003; 15: 2296-2307https://doi.org/10.1105/tpc.014365Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar These plasma membrane receptors activate an intracellular cascade of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) by an unknown mechanism.10Wang Y. Wu Y. Zhang H. Wang P. Xia Y. Arabidopsis MAPKK kinases YODA, MAPKKK3, and MAPKKK5 are functionally redundant in development and immunity.Plant Physiol. 2022; 190: 206-210https://doi.org/10.1093/plphys/kiac270Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar,11Cho S.K. Larue C.T. Chevalier D. Wang H. Jinn T.-L. Zhang S. Walker J.C. Regulation of floral organ abscission in Arabidopsis thaliana.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 15629-15634https://doi.org/10.1073/pnas.0805539105Crossref PubMed Scopus (264) Google Scholar,12Zhu Q. Shao Y. Ge S. Zhang M. Zhang T. Hu X. Liu Y. Walker J. Zhang S. Xu J. A MAPK cascade downstream of IDA–HAE/HSL2 ligand–receptor pair in lateral root emergence.Nat. Plants. 2019; 5: 414-423https://doi.org/10.1038/s41477-019-0396-xCrossref PubMed Scopus (81) Google Scholar Here, we characterize brassinosteroid signaling kinases (BSKs) as regulators of floral organ abscission in Arabidopsis. BSK1 localizes to the plasma membrane of abscission zone cells, where it interacts with HAESA receptors to regulate abscission. Furthermore, we demonstrate that YODA (YDA) has a leading role among other MAPKKKs in controlling abscission downstream of the HAESA/BSK complex. This kinase axis, comprising a leucine-rich repeat receptor kinase, a BSK, and an MAPKKK, is known to regulate stomatal patterning, early embryo development, and immunity.10Wang Y. Wu Y. Zhang H. Wang P. Xia Y. Arabidopsis MAPKK kinases YODA, MAPKKK3, and MAPKKK5 are functionally redundant in development and immunity.Plant Physiol. 2022; 190: 206-210https://doi.org/10.1093/plphys/kiac270Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar,13Neu A. Eilbert E. Asseck L.Y. Slane D. Henschen A. Wang K. Bürgel P. Hildebrandt M. Musielak T.J. Kolb M. et al.Constitutive signaling activity of a receptor-associated protein links fertilization with embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019; 116: 5795-5804https://doi.org/10.1073/pnas.1815866116Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar,14Wang K. Chen H. Ortega-Perez M. Miao Y. Ma Y. Henschen A. Lohmann J.U. Laubinger S. Bayer M. Independent parental contributions initiate zygote polarization in Arabidopsis thaliana.Curr. Biol. 2021; 31: 4810-4816.e5https://doi.org/10.1016/j.cub.2021.08.033Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (10) Google Scholar,15Liu Y. Leary E. Saffaf O. Frank Baker R. Zhang S. Overlapping functions of YDA and MAPKKK3/MAPKKK5 upstream of MPK3/MPK6 in plant immunity and growth/development.J. Integr. Plant Biol. 2022; 64: 1531-1542https://doi.org/10.1111/jipb.13309Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar,16Sopeña-Torres S. Jordá L. Sánchez-Rodríguez C. Miedes E. Escudero V. Swami S. López G. Piślewska-Bednarek M. Lassowskat I. Lee J. et al.YODA MAP3K kinase regulates plant immune responses conferring broad-spectrum disease resistance.New Phytol. 2018; 218: 661-680https://doi.org/10.1111/nph.15007Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar How specific cellular responses are obtained despite signaling through common effectors is not well understood. We show that the identified abscission-promoting allele of BSK1 also enhances receptor signaling in other BSK-mediated pathways, suggesting conservation of signaling mechanisms. Furthermore, we provide genetic evidence supporting independence of BSK1 function from its kinase activity in several developmental processes. Together, our findings suggest that BSK1 facilitates signaling between plasma membrane receptor kinases and MAPKKKs via conserved mechanisms across multiple facets of plant development.

Development of plant vascular tissues involves tissue specification, growth, pattern formation and cell type differentiation. While later steps are understood in some detail, it is still largely unknown how the tissue is initially specified. We have used the early Arabidopsis embryo as a simple model to study this process. Using a large collection of marker genes, we find that vascular identity is established in the 16-cell embryo. After a transient precursor state however, there is no persistent uniform tissue identity. Auxin is intimately connected to vascular tissue development. We find that while AUXIN RESPONSE FACTOR5/MONOPTEROS/ (ARF5/MP)-dependent auxin response is required, it is not sufficient for tissue establishment. We therefore used a large-scale enhanced Yeast One Hybrid assay to identify potential regulators of vascular identity. Network and functional analysis of suggest that vascular identity is under robust, complex control. We found that one candidate regulator, the G-class bZIP transcription factor GBF2, modulates vascular gene expression, along with its homolog GBF1. Furthermore, GBFs bind to MP and modulate its activity. Our work uncovers components of a gene regulatory network that controls the initiation of vascular tissue identity, one of which involves the interaction of MP and GBF2 proteins.

The phytohormone auxin is involved in almost all developmental processes in land plants. Most, if not all, of these processes are mediated by changes in gene expression. Auxin acts on gene expression through a short nuclear pathway that converges upon the activation of a family of DNA-binding transcription factors. These AUXIN RESPONSE FACTORS (ARFs) are thus the effector of auxin response and translate the chemical signal to the regulation of a defined set of genes. Given the limited number of dedicated components in auxin signaling, distinct properties among the ARF family likely contributes to the establishment of multiple unique auxin responses in plant development. In the 2 decades following the identification of the first ARF in Arabidopsis much has been learnt about how these transcription factors act, and how they generate unique auxin responses. Progress in genetics, biochemistry, genomics and structural biology have helped to develop mechanistic models for ARF action. However, despite intensive efforts, many central questions are yet to be addressed. In this review we highlight what has been learnt about ARF transcription factors, and identify outstanding questions and challenges for the near future.

The signaling molecule auxin is pivotal in coordinating many growth and development processes in plants mainly through the modulation of gene expression. The transcriptional response to auxin is mediated by the family of auxin response factors (ARF). Monomers of this family recognize a DNA motif (TGTC[TC]/[GG]) called the auxin-response element (AuxRE). ARFs can homodimerize through their DNA binding domains (DBD) thereby enabling cooperative binding for a bipartite inverted AuxRE (IR7). In addition to the DBD, most ARFs contain a C-terminal Phox and Bem1p (PB1) domain both capable of homotypic interactions, and mediating interactions with Aux/IAA repressors. Given the dual role of the PB1 domain, and the ability of both DBD and PB1 domain to mediate dimerization, a key question is how each of these domains contributes to conferring DNA-binding specificity and affinity. So far, ARF-ARF and ARF-DNA interactions have mostly been approached using qualitative methods that do not provide a quantitative and dynamic view on the binding equilibria. Here, we utilize a DNA binding assay based on single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) to study the affinity and kinetics of the interaction of several Arabidopsis thaliana ARFs with an IR7 AuxRE. We show that both DBD and PB1 domains of AtARF2 contribute toward DNA binding, and we identify ARF dimer stability as a key parameter in defining affinity and kinetics seen for the DBDs of different AtARFs. Lastly, we derived an analytical solution for a four-state cyclic model that explains both the kinetics and the affinity of the interaction between AtARF2 and IR7. Our work demonstrates that the affinity of ARFs towards composite DNA response elements can be tuned by small changes of their dimerization equilibrium suggesting that this effect has major implications for ARF-mediated transcriptional activity.