In a porcine cystic fibrosis model, lack of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is shown to result in acidification of airway surface liquid (ASL), and this decrease in pH reduces the ability of ASL to kill bacteria; the findings directly link loss of the CFTR anion channel to impaired defence against bacterial infection. The discovery of a link between cystic fibrosis and mutations in the CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) gene has stimulated two decades of extensive research. As a result, the genetic, functional and cellular aspects of CFTR are well known. But despite these advances, it has proved impossible to relate the pathogenesis of bacterial lung infection, the major cause of morbidity and mortality in the disease, to the basic physiological abnormality — the loss of CFTR anion channels. The experiments reported here show that without CFTR, when airway epithelial HCO3 secretion is defective, the pH of the airway surface liquid falls and inhibits antimicrobial function. This impairs the killing of bacteria that enter the lungs. Reducing the pH of the airway surface layer diminished bactericidal activity in wild-type pigs, whereas increasing the pH restored antimicrobial activity in pigs lacking CFTR. These findings link CFTR mutations to defective bacterial eradication, and suggest that increasing the pH of the airway surface liquid might prevent the initial infection in patients with cystic fibrosis. Cystic fibrosis (CF) is a life-shortening disease caused by mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene1. Although bacterial lung infection and the resulting inflammation cause most of the morbidity and mortality, how the loss of CFTR function first disrupts airway host defence has remained uncertain2,3,4,5,6. To investigate the abnormalities that impair elimination when a bacterium lands on the pristine surface of a newborn CF airway, we interrogated the viability of individual bacteria immobilized on solid grids and placed onto the airway surface. As a model, we studied CF pigs, which spontaneously develop hallmark features of CF lung disease7,8. At birth, their lungs lack infection and inflammation, but have a reduced ability to eradicate bacteria8. Here we show that in newborn wild-type pigs, the thin layer of airway surface liquid (ASL) rapidly kills bacteria in vivo, when removed from the lung and in primary epithelial cultures. Lack of CFTR reduces bacterial killing. We found that the ASL pH was more acidic in CF pigs, and reducing pH inhibited the antimicrobial activity of ASL. Reducing ASL pH diminished bacterial killing in wild-type pigs, and, conversely, increasing ASL pH rescued killing in CF pigs. These results directly link the initial host defence defect to the loss of CFTR, an anion channel that facilitates HCO3− transport9,10,11,12,13. Without CFTR, airway epithelial HCO3− secretion is defective, the ASL pH falls and inhibits antimicrobial function, and thereby impairs the killing of bacteria that enter the newborn lung. These findings suggest that increasing ASL pH might prevent the initial infection in patients with CF, and that assaying bacterial killing could report on the benefit of therapeutic interventions.

Almost two decades after CFTR was identified as the gene responsible for cystic fibrosis (CF), we still lack answers to many questions about the pathogenesis of the disease, and it remains incurable. Mice with a disrupted CFTR gene have greatly facilitated CF studies, but the mutant mice do not develop the characteristic manifestations of human CF, including abnormalities of the pancreas, lung, intestine, liver, and other organs. Because pigs share many anatomical and physiological features with humans, we generated pigs with a targeted disruption of both CFTR alleles. Newborn pigs lacking CFTR exhibited defective chloride transport and developed meconium ileus, exocrine pancreatic destruction, and focal biliary cirrhosis, replicating abnormalities seen in newborn humans with CF. The pig model may provide opportunities to address persistent questions about CF pathogenesis and accelerate discovery of strategies for prevention and treatment.

The lungs of just-born piglets with cystic fibrosis fail to efficiently eliminate bacteria, suggesting that lung problems in cystic fibrosis patients may be secondary to impaired antibacterial defense mechanisms.

Organotypic cultures of primary human airway epithelial cells have been used to investigate the morphology, ion and fluid transport, innate immunity, transcytosis, infection, inflammation, signaling, cilia, and repair functions of this complex tissue. However, we do not know how closely these cultures resemble the airway surface epithelium in vivo. In this study, we examined the genome-wide expression profile of tracheal and bronchial human airway epithelia in vivo and compared it with the expression profile of primary cultures of human airway epithelia grown at the air-liquid interface. For comparison, we also investigated the expression profile of Calu-3 cells grown at the air-liquid interface and primary cultures of human airway epithelia submerged in nutrient media. We found that the transcriptional profile of differentiated primary cultures grown at the air-liquid interface most closely resembles that of in vivo airway epithelia, suggesting that the use of primary cultures and the presence of an air-liquid interface are important to recapitulate airway epithelia biology. We describe a high level of similarity between cells of tracheal and bronchial origin within and between different human donors, which suggests a very robust expression profile that is specific to airway cells.

Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is especially severe in aged populations1. Vaccines against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) are highly effective, but vaccine efficacy is partly compromised by the emergence of SARS-CoV-2 variants with enhanced transmissibility2. The emergence of these variants emphasizes the need for further development of anti-SARS-CoV-2 therapies, especially for aged populations. Here we describe the isolation of highly virulent mouse-adapted viruses and use them to test a new therapeutic drug in infected aged animals. Many of the alterations observed in SARS-CoV-2 during mouse adaptation (positions 417, 484, 493, 498 and 501 of the spike protein) also arise in humans in variants of concern2. Their appearance during mouse adaptation indicates that immune pressure is not required for selection. For murine SARS, for which severity is also age dependent, elevated levels of an eicosanoid (prostaglandin D2 (PGD2)) and a phospholipase (phospholipase A2 group 2D (PLA2G2D)) contributed to poor outcomes in aged mice3,4. mRNA expression of PLA2G2D and prostaglandin D2 receptor (PTGDR), and production of PGD2 also increase with ageing and after SARS-CoV-2 infection in dendritic cells derived from human peripheral blood mononuclear cells. Using our mouse-adapted SARS-CoV-2, we show that middle-aged mice lacking expression of PTGDR or PLA2G2D are protected from severe disease. Furthermore, treatment with a PTGDR antagonist, asapiprant, protected aged mice from lethal infection. PTGDR antagonism is one of the first interventions in SARS-CoV-2-infected animals that specifically protects aged animals, suggesting that the PLA2G2D-PGD2/PTGDR pathway is a useful target for therapeutic interventions.

Zoonotically transmitted coronaviruses are responsible for three disease outbreaks since 2002, including the current COVID-19 pandemic, caused by SARS-CoV-2. Its efficient transmission and range of disease severity raise questions regarding the contributions of virus-receptor interactions. ACE2 is a host ectopeptidase and the receptor for SARS-CoV-2. Numerous reports describe ACE2 mRNA abundance and tissue distribution; however, mRNA abundance is not always representative of protein levels. Currently, there is limited data evaluating ACE2 protein and its correlation with other SARS-CoV-2 susceptibility factors.

Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is especially severe in aged populations

ABSTRACT Measles virus (MeV) is the most contagious human virus, but we do not fully understand why. Unlike most respiratory viruses, MeV does not infect the airway epithelium immediately. MeV traverses the epithelium within immune cells that carry it to lymphatic organs where amplification occurs. Infected immune cells then synchronously deliver large amounts of virus to the airways. However, our understanding of MeV replication in airway epithelia is limited. To model it, we use well-differentiated primary cultures of human airway epithelial cells (HAE) from lung donors. In HAE, MeV spreads directly cell-to-cell forming infectious centers that grow for ∼3-5 days, are stable for a few days, and then disappear. Transepithelial electrical resistance remains intact during the entire course of HAE infection, thus we hypothesized that MeV infectious centers may slough off while preserving epithelial function. After documenting by confocal microscopy that infectious centers progressively detach from HAE, we recovered apical washes and separated cell-associated from cell-free virus by centrifugation. Virus titers were about 10 times higher in the cell-associated fraction than in the supernatant. In sloughed infectious centers, ciliary beating persisted and apoptotic markers were not readily detected, suggesting that they retain functional metabolism. Cell-associated MeV infected primary human monocyte-derived macrophages, modeling the first stage of infection in a new host. Single-cell RNA sequencing identified wound healing, cell growth, and cell differentiation as biological processes relevant for infectious center sloughing. 5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) staining located proliferating cells underneath infectious centers. Thus, cells located below infectious centers divide and differentiate to repair the extruded infected epithelial patch. As an extension of these studies, we postulate that expulsion of infectious centers through coughing and sneezing could contribute to MeV’s strikingly high reproductive number by allowing the virus to survive longer in the environment and by delivering a high infectious dose to the next host. AUTHOR SUMMARY Measles virus (MeV) is a respiratory pathogen that infects millions worldwide each year. Although sometimes mischaracterized as an innocuous childhood disease, measles remains a leading cause of death for children under five. MeV is the most contagious human virus and requires vaccination rates above 90% to maintain herd immunity. Global decreases in vaccination rates over the past ten years contributed to recent, widespread MeV outbreaks. We uncover here a novel mechanism by which MeV exits the human airways that may explain why it is much more contagious than other viruses. We document that infected cells containing cell-associated virus slough en masse from the airway epithelial sheet. These expelled infectious centers are metabolically active and can transmit infection to primary human monocyte-derived macrophages more efficiently than cell-free virus particles. Thus, cell-associated MeV can transmit host-to-host, a new paradigm for efficient respiratory virus transmission.

Abstract Life-long expression of a gene therapy agent likely requires targeting stem cells. Here we ask the question: does viral vector transduction or ectopic expression of a therapeutic transgene preclude airway stem cell function? We used a lentiviral vector containing a GFP or cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ( CFTR ) transgene to transduce primary airway basal cells from human cystic fibrosis (CF) or non-CF lung donors and monitored expression and function after differentiation. Ussing chamber measurements confirmed CFTR-dependent chloride channel activity in CF donor cells. Immunostaining, quantitative real-time PCR, and single-cell sequencing analysis of cell-type markers indicated that vector transduction or CFTR expression does not alter the formation of pseudostratified, fully-differentiated epithelial cell cultures or cell type distribution. These results have important implications for use of gene addition or gene editing strategies as life-long curative approaches for lung genetic diseases.

Abstract RNA sequencing enables high-contents/high-complexity measurements in small molecule screens performed on biological samples. Whereas the costs of DNA sequencing and the complexity of RNA-seq library preparation and analysis have decreased consistently, RNA extraction remains a significant bottleneck for RNA-seq of hundreds of samples in parallel. Direct use of cell lysate for RNA-seq library prep is common in single cell RNA-seq but not in bulk RNA-seq protocols. Recently published protocols suggest that direct lysis is compatible with simplified RNA-seq library prep. Here, we evaluate the performance of a bulk RNA-seq library prep protocol optimized for analysis of many samples of adherent cultured cells in parallel. We combine a low-cost direct lysis buffer compatible with cDNA synthesis (“in-lysate cDNA synthesis”) with Smart-3SEQ and examine the effects of calmidazolium and fludrocortisone-induced perturbation of primary human dermal fibroblasts. We compared this method to normalized purified RNA inputs from matching samples followed by Smart-3SEQ or Illumina TruSeq library prep. Our results show that whereas variable RNA inputs for each sample in the in-lysate cDNA synthesis protocol result in variable sequencing depth, this had minimal effect on data quality, measurement of gene expression patterns, or generation of differentially expressed gene lists. We found that in-lysate cDNA synthesis combined with Smart-3SEQ RNA-seq library prep allows generation of high-quality data when compared to library prep with extracted RNA, or when compared to Illumina TruSeq. Our data show that small molecule screens using RNA-seq are feasible at low reagent and time costs.