We present an analytical method using correlation functions to quantify clustering in super-resolution fluorescence localization images and electron microscopy images of static surfaces in two dimensions. We use this method to quantify how over-counting of labeled molecules contributes to apparent self-clustering and to calculate the effective lateral resolution of an image. This treatment applies to distributions of proteins and lipids in cell membranes, where there is significant interest in using electron microscopy and super-resolution fluorescence localization techniques to probe membrane heterogeneity. When images are quantified using pair auto-correlation functions, the magnitude of apparent clustering arising from over-counting varies inversely with the surface density of labeled molecules and does not depend on the number of times an average molecule is counted. In contrast, we demonstrate that over-counting does not give rise to apparent co-clustering in double label experiments when pair cross-correlation functions are measured. We apply our analytical method to quantify the distribution of the IgE receptor (FcεRI) on the plasma membranes of chemically fixed RBL-2H3 mast cells from images acquired using stochastic optical reconstruction microscopy (STORM/dSTORM) and scanning electron microscopy (SEM). We find that apparent clustering of FcεRI-bound IgE is dominated by over-counting labels on individual complexes when IgE is directly conjugated to organic fluorophores. We verify this observation by measuring pair cross-correlation functions between two distinguishably labeled pools of IgE-FcεRI on the cell surface using both imaging methods. After correcting for over-counting, we observe weak but significant self-clustering of IgE-FcεRI in fluorescence localization measurements, and no residual self-clustering as detected with SEM. We also apply this method to quantify IgE-FcεRI redistribution after deliberate clustering by crosslinking with two distinct trivalent ligands of defined architectures, and we evaluate contributions from both over-counting of labels and redistribution of proteins.

Diverse cellular signaling events, including B cell receptor (BCR) activation, are hypothesized to be facilitated by domains enriched in specific plasma membrane lipids and proteins that resemble liquid-ordered phase-separated domains in model membranes. This concept remains controversial and lacks direct experimental support in intact cells. Here, we visualize ordered and disordered domains in mouse B lymphoma cell membranes using super-resolution fluorescence localization microscopy, demonstrate that clustered BCR resides within ordered phase-like domains capable of sorting key regulators of BCR activation, and present a minimal, predictive model where clustering receptors leads to their collective activation by stabilizing an extended ordered domain. These results provide evidence for the role of membrane domains in BCR signaling and a plausible mechanism of BCR activation via receptor clustering that could be generalized to other signaling pathways. Overall, these studies demonstrate that lipid mediated forces can bias biochemical networks in ways that broadly impact signal transduction.

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cell therapy is effective in treating lymphomas, leukemias, and multiple myeloma in which the tumor cells express high amounts of target antigen. However, achieving durable remission for these hematological malignancies and extending CAR T cell therapy to patients with solid tumors will require receptors that can recognize and eliminate tumor cells with a low density of target antigen. Although CARs were designed to mimic T cell receptor (TCR) signaling, TCRs are at least 100-fold more sensitive to antigen. To design a CAR with improved antigen sensitivity, we directly compared TCR and CAR signaling in primary human T cells. Global phosphoproteomic analysis revealed that key T cell signaling proteins-such as CD3δ, CD3ε, and CD3γ, which comprise a portion of the T cell co-receptor, as well as the TCR adaptor protein LAT-were either not phosphorylated or were only weakly phosphorylated by CAR stimulation. Modifying a commonplace 4-1BB/CD3ζ CAR sequence to better engage CD3ε and LAT using embedded CD3ε or GRB2 domains resulted in enhanced T cell activation in vitro in settings of a low density of antigen, and improved efficacy in in vivo models of lymphoma, leukemia, and breast cancer. These CARs represent examples of alterations in receptor design that were guided by in-depth interrogation of T cell signaling.

SUMMARY Heterogeneity in intact cell plasma membranes has been explained by analogy to coexisting liquid-ordered and liquid-disordered phases, although models based on this idea fall short of describing the rich structure within cell membranes. Here, a new framework of lipid-driven plasma membrane heterogeneity is presented, drawing on quantitative measurements of protein partitioning and dynamics within B cell receptor clusters in live B lymphocyte plasma membranes, compared to coexisting phases in isolated plasma membranes. We propose that membrane domains in cells integrate the thermodynamic state of the membrane and the magnitude of the applied stimulus to give rise to a tunable response. This framework is supported through functional observations of B cell receptor phosphorylation in perturbed systems.

Abstract Single-molecule fluorescence microscopy probes nanoscale, subcellular biology in real time. Existing methods for analyzing single-particle tracking data provide dynamical information, but can suffer from supervisory biases and high uncertainties. Here, we introduce a new approach to analyzing single-molecule trajectories: the S ingle- M olecule A nalysis by U nsupervised G ibbs sampling (SMAUG) algorithm, which uses nonparametric Bayesian statistics to uncover the whole range of information contained within a single-particle trajectory (SPT) dataset. Even in complex systems where multiple biological states lead to a number of observed mobility states, SMAUG provides the number of mobility states, the average diffusion coefficient of single molecules in that state, the fraction of single molecules in that state, the localization noise, and the probability of transitioning between two different states. In this paper, we provide the theoretical background for the SMAUG analysis and then we validate the method using realistic simulations of SPT datasets as well as experiments on a controlled in vitro system. Finally, we demonstrate SMAUG on real experimental systems in both prokaryotes and eukaryotes to measure the motions of the regulatory protein TcpP in Vibrio cholerae and the dynamics of the B-cell receptor antigen response pathway in lymphocytes. Overall, SMAUG provides a mathematically rigorous approach to measuring the real-time dynamics of molecular interactions in living cells. Statement of Significance Super-resolution microscopy allows researchers access to the motions of individual molecules inside living cells. However, due to experimental constraints and unknown interactions between molecules, rigorous conclusions cannot always be made from the resulting datasets when model fitting is used. SMAUG (Single-Molecule Analysis by Unsupervised Gibbs sampling) is an algorithm that uses Bayesian statistical methods to uncover the underlying behavior masked by noisy datasets. This paper outlines the theory behind the SMAUG approach, discusses its implementation, and then uses simulated data and simple experimental systems to show the efficacy of the SMAUG algorithm. Finally, this paper applies the SMAUG method to two model living cellular systems—one bacterial and one mammalian—and reports the dynamics of important membrane proteins to demonstrate the usefulness of SMAUG to a variety of systems.

ii. Summary/Abstract Single molecule imaging in live cells enables the study of protein interactions and dynamics as they participate in signaling processes. When combined with fluorophores that stochastically transition between fluorescent and reversible dark states, as in super-resolution localization imaging, labeled molecules can be visualized in single cells over time. This improvement in sampling enables the study of extended cellular responses at the resolution of single molecule localization. This chapter provides optimized experimental and analytical methods used to quantify protein interactions and dynamics within the membranes of adhered live cells. Importantly, the use of pair-correlation functions resolved in both space and time allows researchers to probe interactions between proteins on biologically relevant distance and time-scales, even though fluorescence localization methods typically require long times to assemble well-sampled reconstructed images. We describe an application of this approach to measure protein interactions in B cell receptor signaling and include sample analysis code for post-processing of imaging data. These methods are quantitative, sensitive, and broadly applicable to a range of signaling systems.