The study of hepatitis C virus (HCV), a major cause of chronic liver disease, has been hampered by the lack of a cell culture system supporting its replication. Here, we have successfully generated infectious pseudo-particles that were assembled by displaying unmodified and functional HCV glycoproteins onto retroviral and lentiviral core particles. The presence of a green fluorescent protein marker gene packaged within these HCV pseudo-particles allowed reliable and fast determination of infectivity mediated by the HCV glycoproteins. Primary hepatocytes as well as hepato-carcinoma cells were found to be the major targets of infection in vitro. High infectivity of the pseudo-particles required both E1 and E2 HCV glycoproteins, and was neutralized by sera from HCV-infected patients and by some anti-E2 monoclonal antibodies. In addition, these pseudo-particles allowed investigation of the role of putative HCV receptors. Although our results tend to confirm their involvement, they provide evidence that neither LDLr nor CD81 is sufficient to mediate HCV cell entry. Altogether, these studies indicate that these pseudo-particles may mimic the early infection steps of parental HCV and will be suitable for the development of much needed new antiviral therapies.

Several cell surface molecules have been proposed as receptor candidates, mediating cell entry of hepatitis C virus (HCV) on the basis of their physical association with virions or with soluble HCV E2 glycoproteins. However, due to the lack of infectious HCV particles, evidence that these receptor candidates support infection was missing. Using our recently described infectious HCV pseudotype particles (HCVpp) that display functional E1E2 glycoprotein complexes, here we show that HCV is a pH-dependent virus, implying that its receptor component(s) mediate virion internalization by endocytosis. Expression of the CD81 tetraspanin in non-permissive CD81-negative hepato-carcinoma cells was sufficient to restore susceptibility to HCVpp infection, confirming its critical role as a cell attachment factor. As a cell surface molecule likely to mediate endosomal trafficking, we demonstrate that the human scavenger receptor class B type 1 (SR-B1), a high-density lipoprotein-internalization molecule that we previously proposed as a novel HCV receptor candidate due to its affinity with E2 glycoproteins, is required for infection of CD81-expressing hepatic cells. By receptor competition assays, we found that SR-B1 antibodies that blocked binding of soluble E2 could prevent HCVpp infectivity. Furthermore, we establish that the hyper-variable region 1 of the HCV E2 glycoprotein is a critical determinant mediating entry in SR-B1-positive cells. Finally, by correlating expression of HCV receptors and infectivity, we suggest that, besides CD81 and SR-B1, additional hepatocyte-specific co-factor(s) are necessary for HCV entry. Several cell surface molecules have been proposed as receptor candidates, mediating cell entry of hepatitis C virus (HCV) on the basis of their physical association with virions or with soluble HCV E2 glycoproteins. However, due to the lack of infectious HCV particles, evidence that these receptor candidates support infection was missing. Using our recently described infectious HCV pseudotype particles (HCVpp) that display functional E1E2 glycoprotein complexes, here we show that HCV is a pH-dependent virus, implying that its receptor component(s) mediate virion internalization by endocytosis. Expression of the CD81 tetraspanin in non-permissive CD81-negative hepato-carcinoma cells was sufficient to restore susceptibility to HCVpp infection, confirming its critical role as a cell attachment factor. As a cell surface molecule likely to mediate endosomal trafficking, we demonstrate that the human scavenger receptor class B type 1 (SR-B1), a high-density lipoprotein-internalization molecule that we previously proposed as a novel HCV receptor candidate due to its affinity with E2 glycoproteins, is required for infection of CD81-expressing hepatic cells. By receptor competition assays, we found that SR-B1 antibodies that blocked binding of soluble E2 could prevent HCVpp infectivity. Furthermore, we establish that the hyper-variable region 1 of the HCV E2 glycoprotein is a critical determinant mediating entry in SR-B1-positive cells. Finally, by correlating expression of HCV receptors and infectivity, we suggest that, besides CD81 and SR-B1, additional hepatocyte-specific co-factor(s) are necessary for HCV entry. Hepatitis C virus (HCV) 1The abbreviations used are: HCV, hepatitis C virus; HCVpp, HCV pseudotype particles; E1, HCV glycoprotein 1; E2, HCV glycoprotein 2; SR-B1, scavenger receptor class B type 1; LDL, low density lipoprotein; LDLr, LDL receptor; MLV, murine leukemia virus; GFP, green fluorescent protein; VSV, vesicular stomatitis virus; VSV-G, VSV glycoprotein; CHO, Chinese hamster ovary; TU, transducing units; FACS, fluorescence-activated cell sorter; HVR1, hyper-variable region 1. is a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma worldwide (1Major M.E. Rehermann B. Feinstone S.M. Knipe D.M. Howley P.M. Fields Virology. 4th Ed. Vol. 1. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA2001: 1127-1162Google Scholar). About 170 million individuals are infected with HCV. The predominant site of replication and probably infection is the liver, yet several studies have suggested that HCV may infect other cell types, such as B cells, monocytes/macrophages, and dendritic cells (2Lerat H. Rumin S. Habersetzer F. Berby F. Trabaud M.A. Trepo C. Inchauspe G. Blood. 1998; 91: 3841-3849Crossref PubMed Google Scholar, 3Navas M.C. Fuchs A. Schvoerer E. Bohbot A. Aubertin A.M. Stoll-Keller F. J. Med. Virol. 2002; 67: 152-161Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar) where it could induce immune dysfunctions. Understanding the molecular basis by which HCV targets liver cells and extra-hepatic sites is critical to unravel the mechanisms of its pathogenesis and disease chronicity. Although substantial progresses have been made on the molecular knowledge of HCV proteins and genomic replication, there is still no efficient and reliable cell culture system available to amplify this virus (4Lindenbach B.D. Rice C.M. Knipe D.M. Howley P.M. Fields Virology. 4th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA2001: 991-1042Google Scholar). This represents a major hurdle for the characterization of some steps of HCV lifecycle, such as viral assembly and cell entry. Several surrogate models of HCV virions have been developed to facilitate the study of the steps of cell entry. Production of HCV virus-like particles in insect cells has already been reported (5Baumert T.F. Ito S. Wong D.T. Liang T.J. J. Virol. 1998; 72: 3827-3836Crossref PubMed Google Scholar, 6Owsianka A. Clayton R.F. Loomis-Price L.D. McKeating J.A. Patel A.H. J. Gen. Virol. 2001; 82: 1877-1883Crossref PubMed Scopus (165) Google Scholar, 7Triyatni M. Saunier B. Maruvada P. Davis A.R. Ulianich L. Heller T. Patel A. Kohn L.D. Liang T.J. J. Virol. 2002; 76: 9335-9344Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar, 8Wellnitz S. Klumpp B. Barth H. Ito S. Depla E. Dubuisson J. Blum H.E. Baumert T.F. J. Virol. 2002; 76: 1181-1193Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar). Yet, although useful to analyze interactions with the cell surface, these particles were not infectious and did not permit functional investigation of the putative HCV receptors. Alternatively, generation of viral pseudotypes is one of the most widely used methods for assaying functional receptors, allowing attachment, penetration, and uncoating to be studied. Thus, pseudotyped vesicular stomatitis virus (VSV) particles have been engineered with chimeric E1 and/or E2 HCV glycoproteins whose transmembrane domains were modified to allow transport to and assembly at the cell surface (9Buonocore L. Blight K.J. Rice C.M. Rose J.K. J. Virol. 2002; 76: 6865-6872Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 10Flint M. Thomas J.M. Maidens C.M. Shotton C. Levy S. Barclay W.S. McKeating J.A. J. Virol. 1999; 73: 6782-6790Crossref PubMed Google Scholar, 11Lagging L.M. Meyer K. Owens R.J. Ray R. J. Virol. 1998; 72: 3539-3546Crossref PubMed Google Scholar, 12Matsuura Y. Tani H. Suzuki K. Kimura-Someya T. Suzuki R. Aizaki H. Ishii K. Moriishi K. Robison C.S. Whitt M.A. Miyamura T. Virology. 2001; 286: 263-275Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar, 13Takikawa S. Ishii K. Aizaki H. Suzuki T. Asakura H. Matsuura Y. Miyamura T. J. Virol. 2000; 74: 5066-5074Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar). However, as such modifications disturb conformation and functions of the E1E2 complexes (12Matsuura Y. Tani H. Suzuki K. Kimura-Someya T. Suzuki R. Aizaki H. Ishii K. Moriishi K. Robison C.S. Whitt M.A. Miyamura T. Virology. 2001; 286: 263-275Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar), their use as a tool to investigate HCV assembly and cell entry remains controversial (9Buonocore L. Blight K.J. Rice C.M. Rose J.K. J. Virol. 2002; 76: 6865-6872Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). Recently, we have successfully generated infectious HCV pseudotype particles that were assembled by displaying unmodified and functional HCV glycoproteins onto retroviral and lentiviral core particles (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). The presence of a marker gene packaged within these HCV pseudotype particles (HCVpp) allowed reliable and fast determination of infectivity mediated by the HCV glycoproteins. Our current knowledge of these particles indicates that they mimic the early infection steps of parental HCV as they exhibit a preferential tropism for hepatic cells and as they are specifically neutralized by anti-E2 monoclonal antibodies as well as sera of HCV-infected patients. Our results indicate that the E1 and E2 HCV glycoproteins represent the envelope glycoproteins of wild-type HCV and are both required for infection (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). The infectivity of E1E2-pseudotyped retroviruses for similar cells was confirmed by others, as was the ability of monoclonal antibodies to neutralize the viral particles (15Drummer H.E. Maerz A. Poumbourios P. FEBS Lett. 2003; 546: 385-390Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar, 16Hsu M. Zhang J. Flint M. Logvinoff C. Cheng-Mayer C. Rice C.M. McKeating J.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 7271-7276Crossref PubMed Scopus (691) Google Scholar). These pseudotype particles may therefore allow for the first time to decipher the mechanisms of HCV entry into cells. We recently identified the human scavenger receptor class B type 1 (SR-B1), a high-density lipoprotein-binding molecule, as a putative HCV receptor because of its affinity to soluble E2 glycoproteins (17Scarselli E. Ansuini H. Cerino R. Roccasecca R. Acali S. Filocamo G. Traboni C. Nicosia A. Cortese R. Vitelli A. EMBO J. 2002; 21: 5017-5025Crossref PubMed Scopus (956) Google Scholar). Here, we used HCVpp to determine the role of SR-B1 in HCV entry. We show that SR-B1 is required for infection of cells that also express the CD81 tetraspanin and the density lipoprotein receptor (LDLr), two other previously proposed HCV receptor candidates (18Agnello V. Abel G. Elfahal M. Knight G.B. Zhang Q.X. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 12766-12771Crossref PubMed Scopus (806) Google Scholar, 19Pileri P. Uematsu Y. Campagnoli S. Galli G. Falugi F. Petracca R. Weiner A.J. Houghton M. Rosa D. Grandi G. Abrignani S. Science. 1998; 282: 938-941Crossref PubMed Scopus (1798) Google Scholar). Furthermore, we establish that the hyper-variable region 1 of the HCV E2 glycoprotein is a critical determinant mediating entry in SR-B1-positive cells. Finally, our data indicate that, in addition to LDLr, CD81, and SR-B1, liver-specific co-factor(s) are necessary for HCV entry. Expression Constructs and Production of HCV Pseudotype Particles—Expression vectors for E1E2 glycoproteins of 1a and 1b genotypes have been described previously (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). They were used to construct by PCR-mediated and oligonucleotide site-directed mutagenesis (details and sequences available upon request) the expression vectors for the mutant E2 glycoproteins that harbor the deletion of the hyper-variable region 1 (del384–410) and/or the V514M and L615H point mutations. The CMV-Gag-Pol murine leukemia virus (MLV) packaging construct, encoding the MLV gag and pol genes, and the MLV-GFP plasmid, encoding an MLV-based transfer vector containing the GFP marker gene, have been described previously (20Nègre D. Mangeot P. Duisit G. Blanchard S. Vidalain P. Leissner P. Winter A. Rabourdin-Combe C. Mehtali M. Moullier P. Darlix J.-L. Cosset F.-L. Gene. Ther. 2000; 7: 1613-1623Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar). The phCMV-G, phCMV-4070A, phCMV-HA, and phCMV-RD (21Sandrin V. Boson B. Salmon P. Gay W. Nègre D. LeGrand R. Trono D. Cosset F.-L. Blood. 2002; 100: 823-832Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar) expression vectors encode the VSV G protein, the amphotropic MLV glycoprotein, the fowl plague virus hemagglutinin, and the feline endogenous virus RD114 glycoprotein, respectively. Production of HCV pseudotype particles was carried out as described previously (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). Briefly, 293T cells were transfected with expression vectors encoding the viral components, i.e. E1E2 glycoproteins, retroviral core proteins, and packaging-competent GFP-containing retroviral transfer vectors, using a calcium-phosphate transfection protocol (Clontech, Le Pont de Claix, France). Supernatants containing the pseudotype particles were harvested 24 h later, filtered through 0.45-μm pore-sized membranes, and used in infection assays. Cells and Infection Assays—Huh-7 human hepatocellular carcinoma (22Nakabayashi H. Taketa K. Miyano K. Yamane T. Sato J. Cancer Res. 1982; 42: 3858-3863PubMed Google Scholar), PLC/PRF/5 human hepatoma (CRL-8024), Hep3B human hepatocellular carcinoma (HB-8064), HepG2 human hepatocellular carcinoma (HB-8065), 293 human embryo kidney cells (ATCC CRL-1573), HOS human osteosarcoma (CRL-1543), TE671 human rhabdomyosarcoma (CRL-8805), Molt-4 human lymphoblastic leukemia (CRL-1582), HeLa human cervix adenocarcinoma (CCL-2), SW-13 human adreno-cortical carcinoma (CCL-105), and CHO Chinese hamster ovary (CCL-61) were grown as recommended by the ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD). 293-SR-B1 cells were derived from 293 cells by transfection with pcDNA3-SRB1, an expression vector encoding SR-B1 (or CLA-1), the human scavenger receptor class B type 1 (GenBank™ accession number Z22555) (23Calvo D. Vega M.A. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18929-18935Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). CHO-SR-B1 cells were described previously (17Scarselli E. Ansuini H. Cerino R. Roccasecca R. Acali S. Filocamo G. Traboni C. Nicosia A. Cortese R. Vitelli A. EMBO J. 2002; 21: 5017-5025Crossref PubMed Scopus (956) Google Scholar). CHO-CD81/SR-B1 and HepG2-CD81 cells were obtained by infection of CHO-SR-B1 and HepG2 cells, respectively, with a retroviral vector containing the human CD81 gene (GenBank™ accession number NM_004356). Construct details are available upon request. Infection assays were performed as described previously (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). Unless otherwise indicated, dilutions of viral supernatants containing the pseudotype particles were added to the cells seeded the day before and plates were incubated for 3 h. The supernatants were then removed and the cells incubated in regular medium for 72 h at 37 °C. The infectious titers, expressed as transducing units (TU)/ml, were deduced from the transduction efficiencies, determined as the percentage of GFP-positive cells measured by FACS analysis (21Sandrin V. Boson B. Salmon P. Gay W. Nègre D. LeGrand R. Trono D. Cosset F.-L. Blood. 2002; 100: 823-832Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar). Antibodies—E1 and E2 glycoproteins were detected with the A4 (24Flint M. Maidens C. Loomis-Price L.D. Shotton C. Dubuisson J. Monk P. Higginbottom A. Levy S. McKeating J.A. J. Virol. 1999; 73: 6235-6244Crossref PubMed Google Scholar) and H52 (25Dubuisson J. Hsu H.H. Cheung R.C. Greenberg H.B. Russell D.G. Rice C.M. J. Virol. 1994; 68: 6147-6160Crossref PubMed Google Scholar) monoclonal antibodies, respectively. HCVpp core proteins were detected with an anti-capsid (MLV CA) antiserum (ViroMed Biosafety Laboratories). These reagents were used in Western blot analysis of purified pseudotype particles as previously described (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). JS-81 (BD Biosciences) is a monoclonal antibody reactive with CD81. 15C8 (Oncogene-Science, France) is a monoclonal antibody reactive with the human LDL receptor. The mouse SR-B1 polyclonal serum was raised by muscle genetic immunization of BALB/c mice, using plasmid pVJ-hSR-B1 harboring the full-length human SR-B1 cDNA. Immunization protocol and plasmid vector have been previously described (26Zucchelli S. Roccasecca R. Meola A. Ercole B.B. Tafi R. Dubuisson J. Galfre G. Cortese R. Nicosia A. Hepatology. 2001; 33: 692-703Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar). The preimmune sera were collected from the same mice bleeded before immunization. The rat monoclonal antibody 9/27 recognizes an epitope contained in the hypervariable region of the E2 protein of genotype 1a (6Owsianka A. Clayton R.F. Loomis-Price L.D. McKeating J.A. Patel A.H. J. Gen. Virol. 2001; 82: 1877-1883Crossref PubMed Scopus (165) Google Scholar). Cell Binding Assays of E2 Glycoproteins—E2 soluble proteins harboring a C-terminal histidine tag were produced in the supernatants of 293 cells, as previously described (27Roccasecca R. Ansuini H. Vitelli A. Meola A. Scarselli E. Acali S. Pezzanera M. Ercole B.B. McKeating J. Yagnik A. Lahm A. Tramontano A. Cortese R. Nicosia A. J. Virol. 2003; 77: 1856-1867Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). Binding of E2 to the cell surface was analyzed using a FACS-based assay. Cells were washed twice in phosphate-buffered saline, 0.2% bovine serum albumin, 10 mm Hepes (FACS buffer). Then, 4 × 105 cells were allowed to bind E2 concentrated supernatants at room temperature for 1 h. After one washing, a biotinylated anti-penta-His mouse monoclonal antibody (Qiagen) was added at a concentration of 2 μg/ml for 30 min at room temperature. Cells were washed again, and cell-bound antibodies were revealed by Streptavidin-R-phycoerythrin conjugated antibodies (Qiagen). For inhibition of binding, cells were pre-incubated with anti-SR-B1 serum, 30 min at 4 °C, as described previously (27Roccasecca R. Ansuini H. Vitelli A. Meola A. Scarselli E. Acali S. Pezzanera M. Ercole B.B. McKeating J. Yagnik A. Lahm A. Tramontano A. Cortese R. Nicosia A. J. Virol. 2003; 77: 1856-1867Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). Cell Entry of HCVpp Is pH-dependent—Enveloped viruses penetrate the host cells by a process of fusion between the viral and cell membranes that is catalyzed by a fusogenic activity harbored by viral surface glycoproteins. Activation of such fusion properties occurs in an acid pH-dependent manner, via acidified endosomal vesicles into which the virions are routed following receptor binding (28Sieczkarski S.B. Whittaker G.R. J. Gen. Virol. 2002; 83: 1535-1545Crossref PubMed Scopus (401) Google Scholar), or, alternatively, in a pH-independent manner via direct interaction of the viral glycoproteins with their receptors. These two cell entry pathways can be distinguished by assessing the effect in infection assays of drugs that inhibit endosomal-pH acidification, such as weak bases (e.g. chloroquine), and vacuolar H(+)-ATPase inhibitors (e.g. bafilomycin A1) (28Sieczkarski S.B. Whittaker G.R. J. Gen. Virol. 2002; 83: 1535-1545Crossref PubMed Scopus (401) Google Scholar). We determined whether entry of HCVpp in Huh-7 hepato-carcinoma cells is likely to proceed via internalization by treating target cells before and during infection with bafilomycin A1. Infectivity of control pseudotype particles generated with pH-independent glycoproteins from MLV-A or RD114 was not affected by bafilomycin A1, at concentrations of up to 50 nm (Fig. 1), consistent with the pH-independent entry route adopted by these retroviruses (29McClure M.O. Sommerfelt M.A. Marsh M. Weiss R.A. J. Gen. Virol. 1990; 71: 767-773Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar). That bafilomycin A1 seemingly reduced the infectivity of these two control viruses at 100 nm could be clearly attributed to cell toxicity of the drug (data not shown). In contrast, bafilomycin A1 reduced in a dose-dependent manner the infectious titers of HCVpp, as well as the infectivity of pseudotype particles generated with pH-dependent glycoproteins from fowl-plague virus, an avian influenza virus, or from VSV. At 100 nm of bafilomycin A1, the titers of the HCVpp and the pseudotype particles coated with FPV hemagglutinin were reduced by a factor of 30–50-fold (Fig. 1). Similar results were obtained with chloroquine and when using Hep3B as alternative target cells (data not shown). These data indicated that the fusion-activation of HCV E1E2 glycoproteins is pH-dependent and that cell entry of HCVpp most likely occurs by endocytosis. Thus some of the receptors used by HCV to infect the target cells may be responsible for virion internalization. CD81 and SR-B1 Co-expression Is Not Sufficient for HCVpp Cell Entry—The LDLr, the CD81 tetraspanin, and the SR-B1 have been proposed as putative HCV receptors mediating entry into hepatic cells (17Scarselli E. Ansuini H. Cerino R. Roccasecca R. Acali S. Filocamo G. Traboni C. Nicosia A. Cortese R. Vitelli A. EMBO J. 2002; 21: 5017-5025Crossref PubMed Scopus (956) Google Scholar, 18Agnello V. Abel G. Elfahal M. Knight G.B. Zhang Q.X. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 12766-12771Crossref PubMed Scopus (806) Google Scholar, 19Pileri P. Uematsu Y. Campagnoli S. Galli G. Falugi F. Petracca R. Weiner A.J. Houghton M. Rosa D. Grandi G. Abrignani S. Science. 1998; 282: 938-941Crossref PubMed Scopus (1798) Google Scholar, 30Monazahian M. Bohme I. Bonk S. Koch A. Scholz C. Grethe S. Thomssen R. J. Med. Virol. 1999; 57: 223-229Crossref PubMed Scopus (301) Google Scholar) on the basis of their physical association with virions or with soluble E2 glycoproteins. Although virion association to LDLr is most likely due to indirect interaction, via virion-bound apolipoproteins (31Andre P. Komurian-Pradel F. Deforges S. Perret M. Berland J.L. Sodoyer M. Pol S. Brechot C. Paranhos-Baccala G. Lotteau V. J. Virol. 2002; 76: 6919-6928Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar), direct interaction between soluble E2 and CD81 or SR-B1 could be demonstrated (17Scarselli E. Ansuini H. Cerino R. Roccasecca R. Acali S. Filocamo G. Traboni C. Nicosia A. Cortese R. Vitelli A. EMBO J. 2002; 21: 5017-5025Crossref PubMed Scopus (956) Google Scholar, 27Roccasecca R. Ansuini H. Vitelli A. Meola A. Scarselli E. Acali S. Pezzanera M. Ercole B.B. McKeating J. Yagnik A. Lahm A. Tramontano A. Cortese R. Nicosia A. J. Virol. 2003; 77: 1856-1867Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). However, due to the lack of infectious HCV particles, evidence that these receptor candidates could support infection was missing. By receptor competition assays, we recently provided evidence that CD81 was involved in the early steps of infection, but was not sufficient to permit infection (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). Indeed, non-hepatic human cells that express CD81 were found to be not or very poorly permissive to infection (Table I), with infectious titers of HCVpp more than 100-fold lower than those measured on Huh-7 cells. Furthermore, ectopic expression of human CD81 in non-permissive murine cells did not restore infection (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). Thus, hepato-carcinoma cells, which coexpress LDLr, CD81, and SR-B1, exhibited the maximal levels of infectivity. Therefore, because SR-B1 is expressed in most cells types, though at highly variable levels (Table I), non-permissiveness to infection may be due to lack of sufficient levels of SR-B1 expression, or, alternatively, to lack of a critical hepatocyte factor(s). To address either of these possibilities, we performed infection assays in CHO cells and 293 human embryo kidney cells that expressed no and low levels of SR-B1, respectively (Table I). CHO cells, which are not permissive to HCVpp infection (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar), were engineered to allow stable and constitutive expression of CD81 alone, SR-B1 alone, or both molecules. Expression of either molecule was sufficient to allow binding of E2 soluble glycoproteins (17Scarselli E. Ansuini H. Cerino R. Roccasecca R. Acali S. Filocamo G. Traboni C. Nicosia A. Cortese R. Vitelli A. EMBO J. 2002; 21: 5017-5025Crossref PubMed Scopus (956) Google Scholar, 27Roccasecca R. Ansuini H. Vitelli A. Meola A. Scarselli E. Acali S. Pezzanera M. Ercole B.B. McKeating J. Yagnik A. Lahm A. Tramontano A. Cortese R. Nicosia A. J. Virol. 2003; 77: 1856-1867Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar). All these CHO-derived cells were highly permissive to infection with control pseudotype particles generated with the VSV-G glycoprotein, which binds a non-related receptor. However, despite densities of CD81 and/or SR-B1 molecules similar if not higher than that of the highly permissive Huh-7 cells (Table I), we found no evidence for infection with HCVpp based on genotype 1a (H77 strain) and 1b (J strain) (Fig. 2). In contrast, over-expression of SR-B1 in the poorly permissive 293 cells (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar), which naturally express abundant levels of CD81 but very low levels of SR-B1 (Table I), resulted in increased levels of infection for both HCVpp-1a and -1b. Using HCVpp harboring a lacZ marker gene that allows the precise determination of low levels of infectivity in contrast to the GFP marker gene, over 10-fold increased infectivity were detected in 293-SR-B1 cells; yet the infectious titers remained below 103 TU/ml (Table I). Furthermore, we found that several human cells of non-hepatic origin, e.g. HeLa and SW13, expressed LDLr, CD81, and SR-B1 at levels comparable with those detected in hepato-carcinoma cells but were poorly permissive to infection, with infectious titers of HCVpp lower than 103 TU/ml (Table I). Altogether these results indicate that although hCD81 and/or SR-B1 bind HCV E2 glycoproteins and might play a role in cell surface attachment and internalization of HCV, their co-expression in a non-hepatic cell background is not sufficient to support efficient HCVpp infection. Additional interactions between the virions and hepatic cell surface components are likely necessary to allow HCVpp cell entry.Table IExpression of CD81 and SR-B1 and permissivity to infectionCell linesTissueHLDLraDetection of human LDLr using 15C8 antibodies on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI (mean fluorescent intensity) shift of 1; +/-, MFI shift between 2 and 4; +, MFI shift between 4 and 10; ++, MFI shift over 10.hCD81bDetection of human CD81 using JS-81 antibodies on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI shift of 1; +, MFI shift between 1 and 50; ++, MFI shift over 50.hSR-B1cDetection of human SR-B1 using mouse SR-B1 serum diluted 1/100 on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI shift of less than 2; +/-, MFI shift between 2 and 6; +, MFI shift between 6 and 20; ++, MFI shift over 20.InfectivitydInfectivity of HCVpp of genotype 1a and 1b harboring the GFP marker gene. ++, titers higher than 105 TU/ml; +, titers between 103 and 105 TU/ml; +/-, titers between 102 and 103 TU/ml; -, titers lower than 102 TU/ml, which corresponds to the threshold of detection of infected cells by FACS analysis.Huh-7Hepatocellular carcinoma++++++PLC/PRF/5Hepatoma+++++Hep3BHepatocellular carcinoma+/-+++HepG2-CD81Hepatocellular carcinoma++++++HepG2Hepatocellular carcinoma+-+++/-SW-13Adrenocortical carcinoma++++/-293-SR-B1Embryo kidney+/-++++/-eOverexpression of SR-B1 in 293 cells resulted in ca. 10-fold increased infectious titers of HCVpp harbouring a lacZ marker gene. Titers in 293 cells: (2.6 ± 0.5) × 101 TU/ml; titers in 293-SR-B1 cells: (4.9 ± 1.5) × 102 TU/ml.293Embryo kidney+/-+++/--eOverexpression of SR-B1 in 293 cells resulted in ca. 10-fold increased infectious titers of HCVpp harbouring a lacZ marker gene. Titers in 293 cells: (2.6 ± 0.5) × 101 TU/ml; titers in 293-SR-B1 cells: (4.9 ± 1.5) × 102 TU/ml.HOSOsteosarcoma+/-+++-HeLaCervix adenocarcinoma++++-TE671Rhabdomyosarcoma-+++/--Molt-4T lymphoblastic leukemia++++--CHOChinese hamster ovary----CHO-CD81/SR-B1Chinese hamster ovary-++++-a Detection of human LDLr using 15C8 antibodies on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI (mean fluorescent intensity) shift of 1; +/-, MFI shift between 2 and 4; +, MFI shift between 4 and 10; ++, MFI shift over 10.b Detection of human CD81 using JS-81 antibodies on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI shift of 1; +, MFI shift between 1 and 50; ++, MFI shift over 50.c Detection of human SR-B1 using mouse SR-B1 serum diluted 1/100 on the surface of the indicated cells by flow cytometry. -, MFI shift of less than 2; +/-, MFI shift between 2 and 6; +, MFI shift between 6 and 20; ++, MFI shift over 20.d Infectivity of HCVpp of genotype 1a and 1b harboring the GFP marker gene. ++, titers higher than 105 TU/ml; +, titers between 103 and 105 TU/ml; +/-, titers between 102 and 103 TU/ml; -, titers lower than 102 TU/ml, which corresponds to the threshold of detection of infected cells by FACS analysis.e Overexpression of SR-B1 in 293 cells resulted in ca. 10-fold increased infectious titers of HCVpp harbouring a lacZ marker gene. Titers in 293 cells: (2.6 ± 0.5) × 101 TU/ml; titers in 293-SR-B1 cells: (4.9 ± 1.5) × 102 TU/ml. Open table in a new tab Both SR-B1 and CD81 Are Necessary for HCVpp Entry into Hepatic Cells—Our previous results established that the highest levels of infectivity were detected in all hepato-carcinoma cells tested, with the notable exception of HepG2 cells (14Bartosch B. Dubuisson J. Cosset F.L. J. Exp. Med. 2003; 197: 633-642Crossref PubMed Scopus (950) Google Scholar). Yet, as shown by us, HepG2 cells are fully competent for binding E2 g

ABSTRACT Due to difficulties in cell culture propagation, the mechanisms of hepatitis C virus (HCV) entry are poorly understood. Here, postbinding cellular mechanisms of HCV entry were studied using both retroviral particles pseudotyped with HCV envelope glycoproteins (HCVpp) and the HCV clone JFH-1 propagated in cell culture (HCVcc). HCVpp entry was measured by quantitative real-time PCR after 3 h of contact with target cells, and HCVcc infection was quantified by immunoblot analysis and immunofluorescence detection of HCV proteins expressed in infected cells. The functional role of clathrin-mediated endocytosis in HCV entry was assessed by small interfering RNA-mediated clathrin heavy chain depletion and with chlorpromazine, an inhibitor of clathrin-coated pit formation at the plasma membrane. In both conditions, HCVpp entry and HCVcc infection were inhibited. HCVcc infection was also inhibited by pretreating target cells with bafilomycin A1 or chloroquine, two drugs known to interfere with endosome acidification. These data indicate that HCV enters target cells by clathrin-mediated endocytosis, followed by a fusion step from within an acidic endosomal compartment.

ABSTRACT A truncated soluble form of the hepatitis C virus E2 glycoprotein, E2 661 , binds specifically to the surface of cells expressing human CD81 (hCD81) but not other members of the tetraspanin family (CD9, CD63, and CD151). No differences were noted between the level of E2 661 binding to hCD81 expressed on the surface of rat RBL or KM3 cells compared to Daudi and Molt-4 cells, suggesting that additional human-cell-specific factors are not required for the primary interaction of E2 with the cell surface. E2 did not interact with African green monkey (AGM) CD81 on the surface of COS cells, which differs from the hCD81 sequence at four residues within the second extracellular region (EC2) (amino acids [aa] 163, 186, 188, and 196), suggesting that one or more of these residues defines the site of interaction with E2. Various recombinant forms of CD81 EC2 show differences in the ability to bind E2, suggesting that CD81 conformation is important for E2 recognition. Regions of E2 involved in the CD81 interaction were analyzed, and our data suggest that the binding site is of a conformational nature involving aa 480 to 493 and 544 to 551 within the E2 glycoprotein. Finally, we demonstrate that ligation of CD81 by E2 661 induced aggregation of lymphoid cells and inhibited B-cell proliferation, demonstrating that E2 interaction with CD81 can modulate cell function.

Hepatitis C virus (HCV) encodes two putative virion glycoproteins (E1 and E2) which are released from the polyprotein by signal peptidase cleavage. In this report, we have characterized the complexes formed between E1 and E2 (called E1E2) for two different HCV strains (H and BK) and studied their intracellular localization. Vaccinia virus and Sindbis virus vectors were used to express the HCV structural proteins in three different cell lines (HepG2, BHK-21, and PK-15). The kinetics of association between E1 and E2, as studied by pulse-chase analysis and coprecipitation of E2 with an anti-E1 monoclonal antibody, indicated that formation of stable E1E2 complexes is slow. The times required for half-maximal association between E1 and E2 were 60 to 85 min for the H strain and more than 165 min for the BK strain. In the presence of nonionic detergents, two forms of E1E2 complexes were detected. The predominant form was a heterodimer of E1 and E2 stabilized by noncovalent interactions. A minor fraction consisted of heterogeneous disulfide-linked aggregates, which most likely represent misfolded complexes. Posttranslational processing and localization of the HCV glycoproteins were examined by acquisition of endoglycosidase H resistance, subcellular fractionation, immunofluorescence, cell surface immunostaining, and immunoelectron microscopy. HCV glycoproteins containing complex N-linked glycans were not observed, and the proteins were not detected at the cell surface. Rather, the proteins localized predominantly to the endoplasmic reticular network, suggesting that some mechanism exists for their retention in this compartment.

Therapeutic options for the highly pathogenic human coronavirus (HCoV) infections are urgently needed. Anticoronavirus therapy is however challenging, as coronaviruses are biologically diverse and rapidly mutating. In this work, the antiviral activity of seven different carbon quantum dots (CQDs) for the treatment of human coronavirus HCoV-229E infections was investigated. The first generation of antiviral CQDs was derived from hydrothermal carbonization of ethylenediamine/citric acid as carbon precursors and postmodified with boronic acid ligands. These nanostructures showed a concentration-dependent virus inactivation with an estimated EC50 of 52 ± 8 μg mL–1. CQDs derived from 4-aminophenylboronic acid without any further modification resulted in the second-generation of anti-HCoV nanomaterials with an EC50 lowered to 5.2 ± 0.7 μg mL–1. The underlying mechanism of action of these CQDs was revealed to be inhibition of HCoV-229E entry that could be due to interaction of the functional groups of the CQDs with HCoV-229E entry receptors; surprisingly, an equally large inhibition activity was observed at the viral replication step.

Here, we identify (−)-epigallocatechin - 3 -gallate (EGCG) as a new inhibitor of hepatitis C virus (HCV) entry. EGCG is a flavonoid present in green tea extract belonging to the subclass of catechins, which has many properties. Particularly, EGCG possesses antiviral activity and impairs cellular lipid metabolism. Because of close links between HCV life cycle and lipid metabolism, we postulated that EGCG may interfere with HCV infection. We demonstrate that a concentration of 50 μM of EGCG inhibits HCV infectivity by more than 90% at an early step of the viral life cycle, most likely the entry step. This inhibition was not observed with other members of the Flaviviridae family tested. The antiviral activity of EGCG on HCV entry was confirmed with pseudoparticles expressing HCV envelope glycoproteins E1 and E2 from six different genotypes. In addition, using binding assays at 4°C, we demonstrate that EGCG prevents attachment of the virus to the cell surface, probably by acting directly on the particle. We also show that EGCG has no effect on viral replication and virion secretion. By inhibiting cell-free virus transmission using agarose or neutralizing antibodies, we show that EGCG inhibits HCV cell-to-cell spread. Finally, by successive inoculation of naïve cells with supernatant of HCV-infected cells in the presence of EGCG, we observed that EGCG leads to undetectable levels of infection after four passages. Conclusion : EGCG is a new, interesting anti-HCV molecule that could be used in combination with other direct-acting antivirals. Furthermore, it is a novel tool to further dissect the mechanisms of HCV entry into the hepatocyte.

Abstract Several genome-wide CRISPR knockout screens have been conducted to identify host factors regulating SARS-CoV-2 replication, but the models used have often relied on overexpression of ACE2 receptor. Additionally, such screens have yet to identify the protease TMPRSS2, known to be important for viral entry at the plasma membrane. Here, we conducted a meta-analysis of these screens and showed a high level of cell-type specificity of the identified hits, arguing for the necessity of additional models to uncover the full landscape of SARS-CoV-2 host factors. We performed genome-wide knockout and activation CRISPR screens in Calu-3 lung epithelial cells, as well as knockout screens in Caco-2 intestinal cells. In addition to identifying ACE2 and TMPRSS2 as top hits, our study reveals a series of so far unidentified and critical host-dependency factors, including the Adaptins AP1G1 and AP1B1 and the flippase ATP8B1. Moreover, new anti-SARS-CoV-2 proteins with potent activity, including several membrane-associated Mucins, IL6R, and CD44 were identified. We further observed that these genes mostly acted at the critical step of viral entry, with the notable exception of ATP8B1, the knockout of which prevented late stages of viral replication. Exploring the pro- and anti-viral breadth of these genes using highly pathogenic MERS-CoV, seasonal HCoV-NL63 and -229E and influenza A orthomyxovirus, we reveal that some genes such as AP1G1 and ATP8B1 are general coronavirus cofactors. In contrast, Mucins recapitulated their known role as a general antiviral defense mechanism. These results demonstrate the value of considering multiple cell models and perturbational modalities for understanding SARS-CoV-2 replication and provide a list of potential new targets for therapeutic interventions.

Abstract Efforts to mitigate COVID-19 include screening of existing antiviral molecules that could be re-purposed to treat SARS-CoV-2 infections. Although SARS-CoV-2 propagates efficiently in African green monkey kidney (Vero) cells, antivirals such as nucleos(t)ide analogs (nucs) often exhibit decreased activity in these cells due to inefficient metabolization. Limited SARS-CoV-2 replication and propagation occurs in human cells, which are the most relevant testing platforms. By performing serial passages of a SARS-CoV-2 isolate in the human hepatoma cell line clone Huh7.5, we selected viral populations with improved viability in human cells. Culture adaptation led to the emergence of a significant number of high frequency changes (>90% of the viral population) in the region coding for the spike glycoprotein, including a deletion of nine amino acids in the N-terminal domain and 3 amino acid changes (E484D, P812R, and Q954H). We demonstrated that the Huh7.5-adapted virus exhibited a >3-Log 10 increase in infectivity titers (TCID 50 ) in Huh7.5 cells, with titers of ~8 Log 10 TCID 50 /mL, and >2-Log 10 increase in the human lung cancer cell line Calu-1, with titers of ~6 Log 10 TCID 50 /mL. Culture adaptation in Huh7.5 cells further permitted efficient infection of the otherwise SARS-CoV-2 refractory human lung cancer cell line A549, with titers of ~6 Log 10 TCID 50 /mL. The enhanced ability of the virus to replicate and propagate in human cells permitted screening of a panel of nine nucs, including broad-spectrum compounds. Remdesivir, EIDD-2801 and to a limited extent galidesivir showed antiviral effect across these human cell lines, whereas sofosbuvir, uprifosbuvir, valopicitabine, mericitabine, ribavirin, and favipiravir had no apparent activity. Importance The cell culture adapted variant of the SARS-CoV-2 virus obtained in the present study, showed significantly enhanced replication and propagation in various human cell lines, including lung derived cells otherwise refractory for infection with the original virus. This SARS-CoV-2 variant will be a valuable tool permitting investigations across human cell types, and studies of identified mutations could contribute to our understanding of viral pathogenesis. In particular, the adapted virus can be a good model for investigations of viral entry and cell tropism for SARS-CoV-2, in which the spike glycoprotein plays a central role. Further, as shown here with the use of remdesivir and EIDD-2801, two nucs with significant inhibitory effect against SARS-CoV-2, large differences in the antiviral activity are observed depending on the cell line. Thus, it is essential to select the most relevant target cells for pre-clinical screenings of antiviral compounds, facilitated by using a virus with broader tropism.

Abstract Drug repurposing has the advantage of shortening regulatory preclinical development steps. Here, we screened a library of drug compounds, already registered in one or several geographical areas, to identify those exhibiting antiviral activity against SARS-CoV-2 with relevant potency. Of the 1,942 compounds tested, 21 exhibited a substantial antiviral activity in Vero-81 cells. Among them, clofoctol, an antibacterial drug used for the treatment of bacterial respiratory tract infections, was further investigated due to favorable safety profile and pharmacokinetic properties. Notably, the peak concentration of clofoctol that can be achieved in human lungs is more than 20 times higher than its IC 50 measured against SARS-CoV-2 in human pulmonary cells. This compound inhibits SARS-CoV-2 at a post-entry step. Lastly, therapeutic treatment of human ACE2 receptor transgenic mice decreased viral load, reduced inflammatory gene expression and lowered pulmonary pathology. Altogether, these data strongly support clofoctol as a therapeutic candidate for the treatment of COVID-19 patients. Summary Antivirals targeting SARS-CoV-2 are sorely needed. In this study, we screened a library of drug compounds and identified clofoctol as an antiviral against SARS-CoV-2. We further demonstrated that, in vivo, this compound reduces inflammatory gene expression and lowers pulmonary pathology.