Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is increasingly being used to determine distances, structures, and dynamics of biomolecules in vitro and in vivo. However, generalized protocols and FRET standards to ensure the reproducibility and accuracy of measurements of FRET efficiencies are currently lacking. Here we report the results of a comparative blind study in which 20 labs determined the FRET efficiencies (E) of several dye-labeled DNA duplexes. Using a unified, straightforward method, we obtained FRET efficiencies with s.d. between ±0.02 and ±0.05. We suggest experimental and computational procedures for converting FRET efficiencies into accurate distances, and discuss potential uncertainties in the experiment and the modeling. Our quantitative assessment of the reproducibility of intensity-based smFRET measurements and a unified correction procedure represents an important step toward the validation of distance networks, with the ultimate aim of achieving reliable structural models of biomolecular systems by smFRET-based hybrid methods.

The root system of higher plants originates from the activity of a root meristem, which comprises a group of highly specialized and long-lasting stem cells. Their maintenance and number is controlled by the quiescent center (QC) cells and by feedback signaling from differentiated cells. Root meristems may have evolved from structurally distinct shoot meristems; however, no common player acting in stemness control has been found so far.We show that CLAVATA1 (CLV1), a key receptor kinase in shoot stemness maintenance, performs a similar but distinct role in root meristems. We report that CLV1 is signaling, activated by the peptide ligand CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION40 (CLE40), together with the receptor kinase ARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) to restrict root stemness. Both CLV1 and ACR4 overlap in their expression domains in the distal root meristem and localize to the plasma membrane (PM) and plasmodesmata (PDs), where ACR4 preferentially accumulates. Using multiparameter fluorescence image spectroscopy (MFIS), we show that CLV1 and ACR4 can form homo- and heteromeric complexes that differ in their composition depending on their subcellular localization.We hypothesize that these homo- and heteromeric complexes may differentially regulate distal root meristem maintenance. We conclude that essential components of the ancestral shoot stemness regulatory system also act in the root and that the specific interaction of CLV1 with ACR4 serves to moderate and control stemness homeostasis in the root meristem. The structural differences between these two meristem types may have necessitated this recruitment of ACR4 for signaling by CLV1.

Abstract Macromolecular phase separation is thought to be one of the processes that drives the formation of membraneless biomolecular condensates in cells. The dynamics of phase separation, especially at low endogenous concentrations found in cells, are thought to follow the tenets of classical nucleation theory describing a sharp transition between a dense phase and a dilute phase characterized by dispersed monomers. Here, we used in vitro biophysical studies to study subsaturated solutions of phase separating RNA binding proteins with intrinsically disordered prion like domains (PLDs) and RNA binding domains (RBDs). Surprisingly, we find that subsaturated solutions are characterized by heterogeneous distributions of clusters comprising tens to hundreds of molecules. These clusters also include low abundance mesoscale species that are several hundreds of nanometers in diameter. Our results show that cluster formation in subsaturated solutions and phase separation in supersaturated solutions are strongly coupled via sequence-encoded interactions. Interestingly, however, cluster formation and phase separation can be decoupled from one another using solutes that impact the solubilities of phase separating proteins. They can also be decoupled by specific types of mutations. Overall, our findings implicate the presence of distinct, sequence-specific energy scales that contribute to the overall phase behaviors of RNA binding proteins. We discuss our findings in the context of theories of associative polymers. Significance Statement Membraneless biomolecular condensates are molecular communities with distinct compositional preferences and functions. Considerable attention has focused on phase separation as the process that gives rise to condensates. Here, we show that subsaturated solutions of RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. The formation of clusters in subsaturated solutions and condensates in supersaturated solution are coupled through sequence-specific interactions. Given the low endogenous concentrations of phase separating proteins, our findings suggest that clusters in subsaturated conditions might be of functional relevance in cells.

Abstract Tc toxins are virulence factors of many insects and human pathogenic bacteria. They attach as soluble prepores to receptors on host cells and following acidification in the late endosome, perforate the cell membrane like a syringe to translocate toxic enzymes into the host cell through their pore-forming channel. Although this complex transformation has been structurally well studied, the functional aspects of this large-scale rearrangement, such as the reaction pathway with possible intermediate states and the resulting temporal evolution have remained elusive. Here, we used an integrated biophysical approach to monitor the prepore-to-pore transition and found that it takes ∼28 h when induced by high pH in the absence of other factors. In the presence of liposomes, an increasingly high pH or receptors, such as heparin or Vsg, the probability to transform prepores to pores increases by a factor of up to 4. This effect can also be mimicked by biotinylation or site-directed mutagenesis of the shell, demonstrating that shell destabilization is a crucial step in prepore-to-pore transition. We show that shell opening is a heterogeneous process with transition times ranging from 60 ms to 1.6 s and resolve three sequential intermediate states: an initial transient intermediate during shell destabilization, a first stable intermediate where the receptor-binding domains on the shell rearrange and a second stable intermediate with an open shell. In contrast, the ejection of the pore-forming channel from the open shell is highly cooperative with a transition time of < 60 ms. This detailed knowledge of the Tc toxin mechanism of action, even in the absence of receptors, is important for the future application of Tc toxins as biomedical devices or biopesticides.

Design principles of Cu( i ) complexes to induce thermally activated delayed fluorescence (TADF) behaviour with an electron-rich carbene moiety are elucidated by means of time-resolved luminescence and high-quality quantum chemical calculations.