Oncogenic alterations to DNA are not transforming in all cellular contexts1,2. This may be due to pre-existing transcriptional programmes in the cell of origin. Here we define anatomic position as a major determinant of why cells respond to specific oncogenes. Cutaneous melanoma arises throughout the body, whereas the acral subtype arises on the palms of the hands, soles of the feet or under the nails3. We sequenced the DNA of cutaneous and acral melanomas from a large cohort of human patients and found a specific enrichment for BRAF mutations in cutaneous melanoma and enrichment for CRKL amplifications in acral melanoma. We modelled these changes in transgenic zebrafish models and found that CRKL-driven tumours formed predominantly in the fins of the fish. The fins are the evolutionary precursors to tetrapod limbs, indicating that melanocytes in these acral locations may be uniquely susceptible to CRKL. RNA profiling of these fin and limb melanocytes, when compared with body melanocytes, revealed a positional identity gene programme typified by posterior HOX13 genes. This positional gene programme synergized with CRKL to amplify insulin-like growth factor (IGF) signalling and drive tumours at acral sites. Abrogation of this CRKL-driven programme eliminated the anatomic specificity of acral melanoma. These data suggest that the anatomic position of the cell of origin endows it with a unique transcriptional state that makes it susceptible to only certain oncogenic insults. In a zebrafish model of human cutaneous and acral melanomas, CRKL amplification causes tumours to favour a fin location, indicating that tumour location is determined by both the driver oncogenes and the pre-existing positional identity gene program.

ABSTRACT Protein phosphorylation is one of the most widespread post-translational modifications in biology. With the advent of mass spectrometry-based phosphoproteomics, more than 200,000 sites of serine and threonine phosphorylation have been reported, of which several thousand have been associated with human diseases and biological processes. For the vast majority of phosphorylation events, it is not yet known which of the more than 300 protein Ser/Thr kinases encoded in the human genome is responsible. Here, we utilize synthetic peptide libraries to profile the substrate sequence specificity of nearly every functional human Ser/Thr kinase. Viewed in its entirety, the substrate specificity of the kinome was substantially more diverse than expected and was driven extensively by negative selectivity. Our kinome-wide dataset was used to computationally annotate and identify the most likely protein kinases for every reported phosphorylation site in the human Ser/Thr phosphoproteome. For the small minority of phosphosites where the protein kinases involved have been previously identified, our predictions were in excellent agreement. When this approach was applied to examine the signaling response of tissues and cell lines to hormones, growth factors, targeted inhibitors, and environmental or genetic perturbations, it revealed unexpected insights into pathway complexity and compensation. Overall, these studies reveal the full extent of substrate specificity of the human Ser/Thr kinome, illuminate cellular signaling responses, and provide a rich resource to link unannotated phosphorylation events to biological pathways.

Summary Oncogenic alterations to DNA are not transforming in all cellular contexts 1, 2 . This may be due to pre-existing transcriptional programs in the cell of origin. Here, we define anatomic position as a major determinant of why cells respond to specific oncogenes. Cutaneous melanoma arises throughout the body, whereas the acral subtype arises on the palms of the hands, soles of the feet, or under the nails 3 . We sequenced the DNA of cutaneous and acral melanomas from a large cohort of human patients and found a specific enrichment for BRAF mutations in cutaneous melanoma but CRKL amplifications in acral melanoma. We modeled these changes in transgenic zebrafish models and found that CRKL-driven tumors predominantly formed in the fins of the fish. The fins are the evolutionary precursors to tetrapod limbs, indicating that melanocytes in these acral locations may be uniquely susceptible to CRKL. RNA profiling of these fin/limb melanocytes, compared to body melanocytes, revealed a positional identity gene program typified by posterior HOX13 genes. This positional gene program synergized with CRKL to drive tumors at acral sites. Abrogation of this CRKL-driven program eliminated the anatomic specificity of acral melanoma. These data suggest that the anatomic position of the cell of origin endows it with a unique transcriptional state that makes it susceptible to only certain oncogenic insults.

ABSTRACT Phenotype switching is a form of cellular plasticity in which cancer cells reversibly move between two opposite extremes - proliferative versus invasive states. While it has long been hypothesised that such switching is triggered by external cues, the identity of these cues has remained elusive. Here, we demonstrate that mechanical confinement mediates phenotype switching through chromatin remodelling. Using a zebrafish model of melanoma coupled with human samples, we profiled tumor cells at the interface between the tumor and surrounding microenvironment. Morphological analysis of these rare cells showed flattened, elliptical nuclei suggestive of mechanical confinement by adjacent tissue. Spatial and single-cell transcriptomics demonstrated that the interface cells adopted a gene program of neuronal invasion, including acquisition of an acetylated tubulin cage that protects the nucleus during migration. We identified the DNA-bending protein HMGB2 as a confinement-induced mediator of the neuronal state. HMGB2 is upregulated in confined cells, and quantitative modelling revealed that confinement prolongs contact time between HMGB2 and chromatin, leading to changes in chromatin configuration that favor the neuronal phenotype. Genetic disruption of HMGB2 showed that it regulates the trade-off between proliferative and invasive states, in which confined HMGB2 high tumor cells are less proliferative but more drug resistant. Our results implicate the mechanical microenvironment as a mechanism driving phenotype switching in melanoma.

Abstract Melanoma exhibits numerous transcriptional cell states including neural crest-like cells as well as pigmented melanocytic cells. How these different cell states relate to distinct tumorigenic phenotypes remains unclear. Here, we use a zebrafish melanoma model to identify a transcriptional program linking the pigmented cell state to a dependence on lipid droplets, the specialized organelle responsible for lipid storage. Single-cell RNA-sequencing of these tumors show a concordance between genes regulating pigmentation and those involved in lipid and oxidative metabolism. This state is conserved in human melanoma specimens. This state demonstrates increased fatty acid uptake, an increased number of lipid droplets, and dependence upon oxidative metabolism. Genetic and pharmacologic suppression of lipid droplet production is sufficient to disrupt oxidative metabolism and slow melanoma growth in vivo. Because the pigmented cell state is linked to poor outcomes in patients, these data indicate a metabolic vulnerability in melanoma that depends on the lipid droplet organelle.

Summary Tumor cells respond to a host of factors from the local microenvironment. Microenvironmental fatty acids can be used by melanoma cells for fuel, but their effects on transcription and epigenetics are still unclear. Here, we show that the fatty acid β-oxidation (FAO) pathway integrates signaling and epigenetics to drive melanoma progression. Using transgenic zebrafish and human cell lines, we find that octanoate, a medium-chain fatty acid, increases tumorigenesis. Octanoate is metabolized via the FAO/ACLY axis into acetyl-CoA, leading to increased histone acetylation. Transcriptomic and epigenetic analyses demonstrate a convergence of inflammatory gene signatures in octanoate-treated melanoma cells. This signature is mediated by TLR4/MyD88 signaling, which is activated by saturated fatty acids like octanoate. Genetic inactivation of either FAO enzymes or TLR4/MyD88 inhibits alterations in histone acetylation, and rescues octanoate-tumor promoting effects. Together, these data demonstrate clear evidence linking fatty acid metabolism and epigenetics to melanoma pathogenesis through TLR4 signaling.

Although virtually all gene networks are predicted to be controlled by miRNAs, the contribution of this important layer of gene regulation to tissue homeostasis in adult animals remains unclear. Gain and loss of function experiments have provided key insights into the specific function of individual miRNAs, but effective genetic tools to study the functional consequences of global inhibition of miRNA activity in vivo are lacking. Here we report the generation and characterization of a genetically engineered mouse strain in which miRNA-mediated gene repression can be reversibly inhibited without affecting miRNA biogenesis or abundance. We demonstrate the usefulness of this strategy by investigating the consequences of acute inhibition of miRNA function in adult animals. We find that different tissues and organs respond differently to global loss of miRNA function. While miRNA-mediated gene repression is essential for the homeostasis of the heart and the skeletal muscle, it is largely dispensable in the majority of other organs. Even in tissues where it is not required for homeostasis, such as the intestine and hematopoietic system, miRNA activity can become essential during regeneration following acute injury. These data support a model where many metazoan tissues primarily rely on miRNA function to respond to potentially pathogenic events.

Abstract The advent of large-scale sequencing in both development and disease has identified large numbers of candidate genes that may be linked to important phenotypes. Validating the function of these candidates in vivo is challenging, due to low efficiency and low throughput of most model systems. We have developed a rapid, scalable system for assessing the role of candidate genes using zebrafish. We generated transgenic zebrafish in which Cas9 was knocked-in to the endogenous mitfa locus, a master transcription factor of the melanocyte lineage. We used this system to identify both cell-autonomous and non-cell autonomous regulators of normal melanocyte development. We then applied this to the melanoma setting to demonstrate that loss of genes required for melanocyte survival can paradoxically promote more aggressive phenotypes, highlighting that in vitro screens can mask in vivo phenotypes. Our high-efficiency genetic approach offers a versatile tool for exploring developmental processes and disease mechanisms that can readily be applied to other cell lineages.

Summary Lipid droplets are fat storage organelles composed of a protein envelope and lipid rich core. Regulation of this protein envelope underlies differential lipid droplet formation and function. In melanoma, lipid droplet formation has been linked to tumor progression and metastasis, but it is unknown whether lipid droplet proteins play a role. To address this, we performed proteomic analysis of the lipid droplet envelope in melanoma. We found that lipid droplet proteins were differentially enriched in distinct melanoma states; from melanocytic to undifferentiated. DHRS3, which converts all-trans-retinal to all-trans-retinol, is upregulated in the MITF LO /undifferentiated/neural crest-like melanoma cell state and reduced in the MITF HI /melanocytic state. Increased DHRS3 expression is sufficient to drive MITF HI /melanocytic cells to a more undifferentiated/invasive state. These changes are due to retinoic acid mediated regulation of melanocytic genes. Our data demonstrate that melanoma cell state can be regulated by expression of lipid droplet proteins which affect downstream retinoid signaling.

Abstract Obesity is a rising concern and associated with an increase in numerous cancers often in a sex-specific manner. Preclinical models are needed to deconvolute the intersection between obesity, sex, and cancer. We have generated a zebrafish system that can be used as a platform for studying these factors. We studied how germline overexpression of AgRP along with a high-fat diet (HFD) affects melanomas dependent on BRAF V600E . This revealed an increase in tumor incidence and area in male obese fish, but not females, consistent with the clinical literature. This is dependent on the somatic mutations, as male tumors generated with an RB1 mutation are sensitive to obesity, but this is not observed with PTEN. These data indicate that both germline and somatic mutations contribute to obesity related effects in melanoma. Given the rapid genetic tools available in the zebrafish, this provides a high-throughput system to dissect the interactions of genetics, diet, sex, and host factors in obesity-related cancers. Summary Statement Due to the rising incidence of obesity, there is a corresponding increased occurrence of obesity related cancers, which is often described to be dependent on sex. Here we developed a model to investigate the intersection between obesity, sex, and cancer.