CD8+ T cell exhaustion is a major barrier to current anti-cancer immunotherapies. Despite this, the developmental biology of exhausted CD8+ T cells (Tex) remains poorly defined, restraining improvement of strategies aimed at “re-invigorating” Tex cells. Here, we defined a four-cell-stage developmental framework for Tex cells. Two TCF1+ progenitor subsets were identified, one tissue restricted and quiescent and one more blood accessible, that gradually lost TCF1 as it divided and converted to a third intermediate Tex subset. This intermediate subset re-engaged some effector biology and increased upon PD-L1 blockade but ultimately converted into a fourth, terminally exhausted subset. By using transcriptional and epigenetic analyses, we identified the control mechanisms underlying subset transitions and defined a key interplay between TCF1, T-bet, and Tox in the process. These data reveal a four-stage developmental hierarchy for Tex cells and define the molecular, transcriptional, and epigenetic mechanisms that could provide opportunities to improve cancer immunotherapy.

TCF-1 is a key transcription factor in progenitor exhausted CD8 T cells (Tex). Moreover, this Tex cell subset mediates responses to PD-1 checkpoint pathway blockade. However, the role of the transcription factor TCF-1 in early fate decisions and initial generation of Tex cells is unclear. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and lineage tracing identified a TCF-1+Ly108+PD-1+ CD8 T cell population that seeds development of mature Tex cells early during chronic infection. TCF-1 mediated the bifurcation between divergent fates, repressing development of terminal KLRG1Hi effectors while fostering KLRG1Lo Tex precursor cells, and PD-1 stabilized this TCF-1+ Tex precursor cell pool. TCF-1 mediated a T-bet-to-Eomes transcription factor transition in Tex precursors by promoting Eomes expression and drove c-Myb expression that controlled Bcl-2 and survival. These data define a role for TCF-1 in early-fate-bifurcation-driving Tex precursor cells and also identify PD-1 as a protector of this early TCF-1 subset.

Exhausted CD8 T cells (TEX) are a distinct state of T cell differentiation associated with failure to clear chronic viruses and cancer. Immunotherapies such as PD-1 blockade can reinvigorate TEX cells, but reinvigoration is not durable. A major unanswered question is whether TEX cells differentiate into functional durable memory T cells (TMEM) upon antigen clearance. Here, using a mouse model, we found that upon eliminating chronic antigenic stimulation, TEX cells partially (re)acquire phenotypic and transcriptional features of TMEM cells. These 'recovering' TEX cells originated from the T cell factor (TCF-1+) TEX progenitor subset. Nevertheless, the recall capacity of these recovering TEX cells remained compromised as compared to TMEM cells. Chromatin-accessibility profiling revealed a failure to recover core memory epigenetic circuits and maintenance of a largely exhausted open chromatin landscape. Thus, despite some phenotypic and transcriptional recovery upon antigen clearance, exhaustion leaves durable epigenetic scars constraining future immune responses. These results support epigenetic remodeling interventions for TEX cell-targeted immunotherapies.

Abstract Rewiring exhausted CD8 T cells (T EX ) towards more functional states is a major goal of cancer immunotherapy but has proven challenging due to the epigenetic stability of T EX . Indeed, T EX are epigenetically programmed by the transcription factor Tox. However, epigenetic changes continue to occur as T EX transition from progenitor (T EX prog ), to intermediate (T EX int ) and terminal (T EX term ) subsets, suggesting potential developmental flexibility in mature T EX subsets. By examining the transition of T EX prog into T EX int cells, we discovered a reciprocally antagonistic circuit between Stat5a and Tox in T EX cells. Stat5-activity controlled T EX int development, antagonized Tox, and instigated partial effector biology. Stat5 was also essential for T EX reinvigoration by PD-1 blockade. Indeed, temporal induction of Stat5-activity in T EX using an orthogonal IL-2/IL2Rβ-pair fostered T EX int cell accumulation and synergized with PD-L1 blockade. Constitutive Stat5a activity (STAT5CA) antagonized Tox-dependent T EX epigenetic programming to generate a durable hybrid effector/NK-like population with enhanced tumor control. Finally, enforcing Stat5-signals in established T EX prog partially rewired the T EX epigenetic landscape towards the effector/memory lineage. Together, these data highlight therapeutic opportunities of manipulating Stat5 to rewire T EX towards a durably protective hybrid program.