CD8+ T cell exhaustion is a major barrier to current anti-cancer immunotherapies. Despite this, the developmental biology of exhausted CD8+ T cells (Tex) remains poorly defined, restraining improvement of strategies aimed at “re-invigorating” Tex cells. Here, we defined a four-cell-stage developmental framework for Tex cells. Two TCF1+ progenitor subsets were identified, one tissue restricted and quiescent and one more blood accessible, that gradually lost TCF1 as it divided and converted to a third intermediate Tex subset. This intermediate subset re-engaged some effector biology and increased upon PD-L1 blockade but ultimately converted into a fourth, terminally exhausted subset. By using transcriptional and epigenetic analyses, we identified the control mechanisms underlying subset transitions and defined a key interplay between TCF1, T-bet, and Tox in the process. These data reveal a four-stage developmental hierarchy for Tex cells and define the molecular, transcriptional, and epigenetic mechanisms that could provide opportunities to improve cancer immunotherapy.

Exhausted CD8 T cells (TEX) are a distinct state of T cell differentiation associated with failure to clear chronic viruses and cancer. Immunotherapies such as PD-1 blockade can reinvigorate TEX cells, but reinvigoration is not durable. A major unanswered question is whether TEX cells differentiate into functional durable memory T cells (TMEM) upon antigen clearance. Here, using a mouse model, we found that upon eliminating chronic antigenic stimulation, TEX cells partially (re)acquire phenotypic and transcriptional features of TMEM cells. These 'recovering' TEX cells originated from the T cell factor (TCF-1+) TEX progenitor subset. Nevertheless, the recall capacity of these recovering TEX cells remained compromised as compared to TMEM cells. Chromatin-accessibility profiling revealed a failure to recover core memory epigenetic circuits and maintenance of a largely exhausted open chromatin landscape. Thus, despite some phenotypic and transcriptional recovery upon antigen clearance, exhaustion leaves durable epigenetic scars constraining future immune responses. These results support epigenetic remodeling interventions for TEX cell-targeted immunotherapies.

Abstract Rewiring exhausted CD8 T cells (T EX ) towards more functional states is a major goal of cancer immunotherapy but has proven challenging due to the epigenetic stability of T EX . Indeed, T EX are epigenetically programmed by the transcription factor Tox. However, epigenetic changes continue to occur as T EX transition from progenitor (T EX prog ), to intermediate (T EX int ) and terminal (T EX term ) subsets, suggesting potential developmental flexibility in mature T EX subsets. By examining the transition of T EX prog into T EX int cells, we discovered a reciprocally antagonistic circuit between Stat5a and Tox in T EX cells. Stat5-activity controlled T EX int development, antagonized Tox, and instigated partial effector biology. Stat5 was also essential for T EX reinvigoration by PD-1 blockade. Indeed, temporal induction of Stat5-activity in T EX using an orthogonal IL-2/IL2Rβ-pair fostered T EX int cell accumulation and synergized with PD-L1 blockade. Constitutive Stat5a activity (STAT5CA) antagonized Tox-dependent T EX epigenetic programming to generate a durable hybrid effector/NK-like population with enhanced tumor control. Finally, enforcing Stat5-signals in established T EX prog partially rewired the T EX epigenetic landscape towards the effector/memory lineage. Together, these data highlight therapeutic opportunities of manipulating Stat5 to rewire T EX towards a durably protective hybrid program.

Abstract Patients with COVID-19 present with a wide variety of clinical manifestations. Thromboembolic events constitute a significant cause of morbidity and mortality in patients infected with SARS-CoV-2. Severe COVID-19 has been associated with hyperinflammation and pre-existing cardiovascular disease. Platelets are important mediators and sensors of inflammation and are directly affected by cardiovascular stressors. In this report, we found that platelets from severely ill, hospitalized COVID-19 patients exhibit higher basal levels of activation measured by P-selectin surface expression, and have a poor functional reserve upon in vitro stimulation. Correlating clinical features to the ability of plasma from COVID-19 patients to stimulate control platelets identified ferritin as a pivotal clinical marker associated with platelet hyperactivation. The COVID-19 plasma-mediated effect on control platelets was highest for patients that subsequently developed inpatient thrombotic events. Proteomic analysis of plasma from COVID-19 patients identified key mediators of inflammation and cardiovascular disease that positively correlated with in vitro platelet activation. Mechanistically, blocking the signaling of the FcγRIIa-Syk and C5a-C5aR pathways on platelets, using antibody-mediated neutralization, IgG depletion or the Syk inhibitor fostamatinib, reversed this hyperactivity driven by COVID-19 plasma and prevented platelet aggregation in endothelial microfluidic chamber conditions, thus identifying these potentially actionable pathways as central for platelet activation and/or vascular complications in COVID-19 patients. In conclusion, we reveal a key role of platelet-mediated immunothrombosis in COVID-19 and identify distinct, clinically relevant, targetable signaling pathways that mediate this effect. These studies have implications for the role of platelet hyperactivation in complications associated with SARS-CoV-2 infection. Cover illustration One-sentence summary The FcγRIIA and C5a-C5aR pathways mediate platelet hyperactivation in COVID-19

Abstract Naïve CD8 T cells can differentiate into effector (T EFF ), memory (T MEM ), or exhausted (T EX ) CD8 T cells. These developmental pathways are associated with distinct transcriptional and epigenetic changes that endow cells with different functional capacities and therefore therapeutic potential. The molecular circuitry underlying these developmental trajectories and the extent of heterogeneity within T EFF , T MEM , T EX populations remain poorly understood. Here, we used the lymphocytic choriomeningitis virus model of acutely-resolved and chronic infection and addressed these gaps by applying longitudinal scRNA-seq and scATAC-seq analysis. These analyses uncovered new subsets, including a subpopulation of T EX expressing NK cell-associated genes, as well as multiple distinct TCF1+ stem/progenitor-like subsets in acute and chronic infection. These data also revealed insights into the reshaping of T EX subsets following PD1 pathway blockade and identified a key role for the cell stress regulator, Btg1, in T EX differentiation. Finally, these results highlighted how the same biological circuits such as cytotoxicity or stem/progenitor pathways can be used by CD8 T cells with highly divergent underlying chromatin landscapes. Thus, this transcriptional and chromatin accessibility landscape map elucidates developmental biology and underlying mechanisms governing T EFF , T MEM , and T EX differentiation.

Abstract The regulatory circuits dictating CD8 + T cell responsiveness versus exhaustion during anti-tumor immunity are incompletely understood. Here we report that tumor-infiltrating antigen-specific PD-1 + TCF-1 − CD8 + T cells express the immunosuppressive cytokine Fgl2. Conditional deletion of Fgl2 specifically in mouse antigen-specific CD8 + T cells prolongs CD8 + T cell persistence, suppresses phenotypic and transcriptomic signatures of T cell exhaustion, and improves control of the tumor. In a mouse model of chronic viral infection, PD-1 + CD8 + T cell-derived Fgl2 also negatively regulates virus-specific T cell responses. In humans, CD8 + T cell-derived Fgl2 is associated with poorer survival in patients with melanoma. Mechanistically, the dampened responsiveness of WT Fgl2 -expressing CD8 + T cells, when compared to Fgl2 -deficient CD8 + T cells, is underpinned by the cell-intrinsic interaction of Fgl2 with CD8 + T cell-expressed FcγRIIB and concomitant caspase 3/7-mediated apoptosis. Our results thus illuminate a cell-autonomous regulatory axis by which PD-1 + CD8 + T cells both express the receptor and secrete its ligand in order to mediate suppression of anti-tumor and anti-viral immunity.

Introduction Follicular helper T cells are essential for helping in the maturation of B cells and the production of neutralizing antibodies (NAbs) during primary viral infections. However, their role during recall responses is unclear. Here, we used hepatitis C virus (HCV) reinfection in humans as a model to study the recall collaborative interaction between circulating CD4 T follicular helper cells (cTfh) and memory B cells (MBCs) leading to the generation of NAbs. Methods We evaluated this interaction longitudinally in subjects who have spontaneously resolved primary HCV infection during a subsequent reinfection episode that resulted in either another spontaneous resolution (SR/SR, n = 14) or chronic infection (SR/CI, n = 8). Results Both groups exhibited virus-specific memory T cells that expanded upon reinfection. However, early expansion of activated cTfh (CD4 + CXCR5 + PD-1 + ICOS + FoxP3 − ) occurred in SR/SR only. The frequency of activated cTfh negatively correlated with time post-infection. Concomitantly, NAbs and HCV-specific MBCs (CD19 + CD27 + IgM − E2-Tet + ) peaked during the early acute phase in SR/SR but not in SR/CI. Finally, the frequency of the activated cTfh1 (CXCR3 + CCR6 − ) subset correlated with the neutralization breadth and potency of NAbs. Conclusion These results underscore a key role for early activation of cTfh1 cells in helping antigen-specific B cells to produce NAbs that mediate the clearance of HCV reinfection.

Abstract T cell differentiation plays a pivotal role in orchestrating immune responses and is crucial for combating infection. Consequently, extensive studies on the cellular, transcriptional, and epigenetic levels have been conducted to deepen our understanding of T cell differentiation. Despite numerous studies revealing disparities between transcriptional and proteomic measurements of the same cells, there has been no direct ex-vivo proteomic profiling of antigen-specific T cell differentiation conducted thus far. In this study, we performed the first longitudinal proteomic profiling of T cell differentiation in vivo, utilizing the well-characterized lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) mouse model. We performed ex-vivo protein abundance profiling of effector to memory differentiation (T EFF /T MEM ) and early to late exhausted T cell (T EX ) differentiation following LCMV infection with the acute Armstrong and chronic Clone-13 strains, respectively. Our findings reveal dynamic alterations of the T cell proteome during differentiation that are either common or distinct for acute and chronic infection, recapitulating existing knowledge. Crucially, our proteomic analyses identify significant differences in the abundance of several proteins between cell states that were not previously highlighted through transcriptional profiling. Our study provides a comprehensive proteomics resource of in vivo T cell differentiation within an antigen-specific context, complementing existing omics data and elucidating putative proteins with potential diagnostic and therapeutic relevance.