Abstract Peptide identification in liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) experiments relies on computational algorithms for matching acquired MS/MS spectra against sequences of candidate peptides using database search tools, such as MSFragger. Here, we present a new tool, MSBooster, for rescoring peptide-to-spectrum matches using additional features incorporating deep learning-based predictions of peptide properties, such as LC retention time, ion mobility, and MS/MS spectra. We demonstrate the utility of MSBooster, in tandem with MSFragger and Percolator, in several different workflows, including nonspecific searches (immunopeptidomics), direct identification of peptides from data independent acquisition data, single-cell proteomics, and data generated on an ion mobility separation-enabled timsTOF MS platform. MSBooster is fast, robust, and fully integrated into the widely used FragPipe computational platform.

The coordinated transcription of genes involves the regulated release of RNA polymerase II (RNAPII) from promoter-proximal sites into active elongation. DNA lesions in transcribed strands block elongation and induce a strong transcriptional arrest. The transcription-coupled repair (TCR) pathway efficiently removes transcription-blocking DNA lesions, but this is not sufficient to resume transcription. Through proteomics screens, we find that the TCR-specific CSB protein loads the evolutionary conserved PAF1 complex (PAF1C) onto RNAPII in promoter-proximal regions in response to DNA damage. PAF1C is dispensable for TCR-mediated repair, but is essential for recovery of RNA synthesis after UV irradiation, suggesting an uncoupling between DNA repair and transcription recovery. Moreover, we find that PAF1C promotes RNAPII pause release in promoter-proximal regions and subsequently acts as a processivity factor that stimulates transcription elongation throughout genes. Our findings expose the molecular basis for a non-canonical PAF1C-dependent pathway that restores transcription throughout the human genome after genotoxic stress.

Abstract Data-independent acquisition (DIA) has become a widely used strategy for peptide and protein quantification in mass spectrometry-based proteomics studies. The integration of ion mobility separation into DIA analysis, such as the diaPASEF technology available on Bruker’s timsTOF platform, further improves the quantification accuracy and protein depth achievable using DIA. We introduce diaTracer, a new spectrum-centric computational tool optimized for diaPASEF data. diaTracer performs three-dimensional (m/z, retention time, ion mobility) peak tracing and feature detection to generate precursor-resolved “pseudo-MS/MS” spectra, facilitating direct (“spectral-library free”) peptide identification and quantification from diaPASEF data. diaTracer is available as a stand-alone tool and is fully integrated into the widely used FragPipe computational platform. We demonstrate the performance of diaTracer and FragPipe using diaPASEF data from cerebrospinal fluid (CSF) and plasma samples, data from phosphoproteomics and HLA immunopeptidomics experiments, and low-input data from a spatial proteomics study. We also show that diaTracer enables unrestricted identification of post-translational modifications from diaPASEF data using open/mass offset searches.

Abstract Data-independent acquisition has become a widely used strategy for peptide and protein quantification in liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based proteomics studies. The integration of ion mobility separation into data-independent acquisition analysis, such as the diaPASEF technology available on Bruker’s timsTOF platform, further improves the quantification accuracy and protein depth achievable using data-independent acquisition. We introduce diaTracer, a spectrum-centric computational tool optimized for diaPASEF data. diaTracer performs three-dimensional (mass to charge ratio, retention time, ion mobility) peak tracing and feature detection to generate precursor-resolved “pseudo-tandem mass spectra”, facilitating direct (“spectral-library free”) peptide identification and quantification from diaPASEF data. diaTracer is available as a stand-alone tool and is fully integrated into the widely used FragPipe computational platform. We demonstrate the performance of diaTracer and FragPipe using diaPASEF data from triple-negative breast cancer, cerebrospinal fluid, and plasma samples, data from phosphoproteomics and human leukocyte antigens immunopeptidomics experiments, and low-input data from a spatial proteomics study. We also show that diaTracer enables unrestricted identification of post-translational modifications from diaPASEF data using open/mass-offset searches.