Abstract The human neocortex has undergone strong evolutionary expansion, largely due to an increased progenitor population, the basal radial glial (bRG) cells. These cells are responsible for the production of a diversity of cell types, but the successive cell fate decisions taken by individual progenitors remains unknown. Here, we developed a semi-automated live/fixed correlative imaging method to generate a map of bRG cell division modes in early fetal tissue and cerebral organoids. Through the analysis of over 1,000 dividing progenitors, we show that bRG cells undergo abundant symmetric amplifying divisions, followed by frequent direct neurogenic divisions, bypassing intermediate progenitors. These direct neurogenic divisions are more abundant in the upper part of the subventricular zone. We furthermore demonstrate asymmetric Notch activation in the self-renewing daughter cells, independently of basal fiber inheritance. Our results reveal a remarkable conservation of fate decisions in cerebral organoids, supporting their value as models of early human neurogenesis.

Abstract Under conditions of starvation, normal and tumor epithelial cells can rewire their metabolism towards the consumption of extracellular matrix-derived components as nutrient sources. The mechanism of pericellular matrix degradation by starved cells has been largely overlooked. Here we show that matrix degradation by breast and pancreatic tumor cells and patient-derived xenograft explants increases by one order of magnitude upon amino acid and growth factor deprivation. In addition, we found that collagenolysis requires the invadopodia components, TKS5 and the transmembrane metalloproteinase, MT1-MMP, which are key to the tumor invasion program. Increased collagenolysis is controlled by mTOR repression upon nutrient depletion or pharmacological inhibition by rapamycin. Our results reveal that starvation hampers clathrin-mediated endocytosis, resulting in MT1-MMP accumulation in arrested clathrin-coated pits. Our study uncovers a new mechanism whereby mTOR repression in starved cells leads to the repurposing of abundant plasma membrane clathrin-coated pits into robust ECM-degradative assemblies.

ABSTRACT The regulation and coordination of developmental processes involves the secretion of morphogens and membrane carriers, including extracellular vesicles, which facilitate their transport over long distance. The long-range activity of the Hedgehog morphogen is conveyed by extracellular vesicles. However, the site and the molecular basis of their biogenesis remains unknown. By combining fluorescence and electron microscopy combined with genetics and cell biology approaches, we investigated the origin and the cellular mechanisms underlying extracellular vesicle biogenesis, and their contribution to Drosophila wing disc development, exploiting Hedgehog as a long-range morphogen. We show that microvilli of Drosophila wing disc epithelium are the site of generation of small extracellular vesicles that transport Hedgehog across the tissue. This process requires the Prominin-like protein, whose activity, together with interacting cytoskeleton components and lipids, is critical for maintaining microvilli integrity and function in secretion. Our results provide the first evidence that microvilli-derived extracellular vesicles contribute to Hedgehog long-range signaling activity highlighting their physiological significance in tissue development in vivo .

ABSTRACT Diploid and stable karyotypes are associated with health and fitness in animals. In contrast, whole genome duplications (WGDs) - doubling full chromosome content - are linked to genetic instability (GIN) and frequently found in human cancers 1–3 . It has been established that WGDs fuel chromosome instability through abnormal mitosis 4–8 , however, the immediate consequences of tetraploidy in the first interphase are not known. This is an essential question because single WGD events such as cytokinesis failure can promote tumorigenesis 9 . Here, we found that newly born tetraploid human cells undergo high rates of DNA damage during DNA replication in the first S-phase. Using DNA combing and single cell sequencing, we show that DNA replication dynamics is perturbed, generating under- and over-replicated regions. Mechanistically, we found that these defects result from the lack of protein mass scaling up at the G1/S transition, which impairs the fidelity of DNA replication. This work shows that within a single interphase, unscheduled tetraploid cells can acquire highly abnormal karyotypes. These findings provide an explanation for the GIN landscape that favors tumorigenesis after tetraploidization.

Abstract Migrating cells present a variety of paths, from random to highly directional ones. While random movement can be explained by basal intrinsic activity, persistent movement requires stable polarization. Here, we quantitatively address emergence of persistent migration in RPE1 cells over long timescales. By live-cell imaging and dynamic micropatterning, we demonstrate that the Nucleus-Golgi axis aligns with direction of migration leading to efficient cell movement. We show that polarized trafficking is directed towards protrusions with a 20 min delay, and that migration becomes random after disrupting internal cell organization. Eventually, we prove that localized optogenetic Cdc42 activation orients the Nucleus-Golgi axis. Our work suggests that polarized trafficking stabilizes the protrusive activity of the cell, while protrusive activity orients this polarity axis, leading to persistent cell migration. Using a minimal physical model, we show that this feedback is sufficient to recapitulate the quantitative properties of cell migration in the timescale of hours.

Errors during cell division lead to aneuploidy, which is associated with genomic instability and cell transformation. In response to aneuploidy, cells activate the tumour suppressor p53 to elicit a surveillance mechanism that halts proliferation and promotes senescence. The molecular sensors that trigger this checkpoint are unclear. Here, using a tunable system of chromosome mis-segregation, we show that mitotic errors trigger nuclear deformation, nuclear softening, and lamin and heterochromatin alterations, leading to rapid p53/p21 activation upon mitotic exit in response to changes in nuclear mechanics. We identify mTORC2 and ATR as nuclear deformation sensors upstream of p53/p21 activation. While triggering mitotic arrest, the chromosome mis-segregation-induced alterations of nuclear envelope mechanics provide a fitness advantage for aneuploid cells by promoting nuclear deformation resilience and enhancing pro-invasive capabilities. Collectively, this work identifies a nuclear mechanical checkpoint triggered by altered chromatin organization that probably plays a critical role in cellular transformation and cancer progression. Hervé, Scelfo et al. show that chromosome mis-segregation induces mTORC2- and ATR-mediated p53 activation through a mechanosensitive checkpoint at the nuclear envelope triggered by altered heterochromatin content and increased nuclear membrane tension.

ABSTRACT Extracellular vesicles (EVs) facilitate the transfer of proteins, lipids and genetic material molecules between cells, and are recognized as an additional mechanism for sustaining intercellular communication. In the epidermis, the communication between melanocytes and keratinocytes is tightly regulated to warrant skin pigmentation. Melanocytes synthetize the melanin pigment in melanosomes that are transported along the dendrites prior to the transfer of melanin pigment to keratinocytes. EVs secreted by keratinocytes modulate pigmentation in melanocytes (Lo Cicero et al., Nat. Comm. 2015). However, whether EVs secreted by keratinocytes contribute to additional processes essential for melanocyte functions remains elusive. Here we show that keratinocyte EVs enhance the ability of melanocytes to generate dendrites, mature melanosomes and their efficient transfer. Further, keratinocyte EVs carrying Rac1 induce important morphological changes, promote dendrite outgrowth, and potentiate melanin transfer to keratinocytes. Hence, in addition to modulate pigmentation, keratinocytes exploit EVs to control melanocyte plasticity and transfer capacity. These data demonstrate that keratinocyte-derived EVs, by regulating melanocyte functions, are major contributors of cutaneous pigmentation and expand our understanding of the mechanism underlying skin pigmentation via a paracrine EV-mediated communication. SIGNIFICANCE STATEMENT Our work uncovers how keratinocyte-derived EVs control melanocyte physiology and functions. By promoting the growth of melanocyte dendrites, maturation, accumulation and peripheral positioning of pigmented melanosomes within the dendrites, and transfer of melanin to keratinocytes, EVs released by keratinocytes control crucial processes in skin photo protection. Importantly, given that dysregulation of these pathways could underlie pigment disorders, melanoma or skin carcinoma, our results open avenues to exploit keratinocyte EVs as tools for the design of new therapies to enhance the ability of melanocytes to provide skin photoprotection, and thus decrease the incidence pigmentary disorders and skin cancers.

Segmentation and detection of biological objects in fluorescence microscopy is of paramount importance in cell imaging. Deep learning approaches have recently shown promise to advance, automatize and accelerate analysis. However, most of the interest has been given to the segmentation of static objects of 2D/3D images whereas the segmentation of dynamic processes obtained from time-lapse acquisitions has been less explored. Here we adapted DeepFinder, a U-net originally designed for 3D noisy cryo-electron tomography (cryo-ET) data, for the detection of rare dynamic exocytosis events (termed ExoDeepFinder) observed in temporal series of 2D Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM) images. ExoDeepFinder achieved good absolute performances with a relatively small training dataset of 60 cells/~12000 events. We rigorously compared deep learning performances with unsupervised conventional methods from the literature. ExoDeepFinder outcompeted the tested methods, but also exhibited a greater plasticity to the experimental conditions when tested under drug treatments and after changes in cell line or imaged reporter. This robustness to unseen experimental conditions did not require re-training demonstrating generalization capability of ExoDeepFinder. ExoDeepFinder, as well as the annotated training datasets, were made transparent and available through an open-source software as well as a Napari plugin and can directly be applied to custom user data. The apparent plasticity and performances of ExoDeepFinder to detect dynamic events open new opportunities for future deep-learning guided analysis of dynamic processes in live-cell imaging.

Abstract During cell adhesion, integrins form clusters that transmit mechanical forces to the substrate (mechanotransduction) and regulate biochemical signaling depending on substrate stiffness. Studies on mechanotransduction significantly advanced our understanding of cell adhesion and were mostly performed on rigid substrates. In contrast to rigid substrates, integrins’ ligands on fluid supported lipid bilayers (SLBs) are mobile and adhesive complexes cannot serve as anchoring points promoting cell spreading. Here, we demonstrate that cells spread on SLBs coated with Invasin, a high-affinity integrin ligand. We show that in contrast to SLBs functionalized with RGD peptides, integrin clusters grow in size and complexity on Invasin-SLBs to a similar extent as on glass. While actomyosin contraction dominates adhesion maturation on stiff substrates, we find that integrin mechanotransduction and cell spreading on fluid SLBs rely on dynein pulling forces along microtubules perpendicular to membranes and microtubules pushing on adhesive complexes, respectively. These forces that may also occur on non-deformable surfaces are revealed in fluid substrate set ups. Our findings, supported by a theoretical model, demonstrate a new mechanical role for microtubules in integrin clustering.

ABSTRACT Intracellular trafficking is mediated by transport carriers that originate by membrane remodeling from donor organelles. Tubular carriers play major roles in the flux of membrane lipids and proteins to acceptor organelles. However, how lipids and proteins impose a tubular geometry on the carriers is incompletely understood. By exploiting imaging approaches at different scales on cells and in vitro membrane systems, we show that phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) and biogenesis of lysosome-related organelles complex 1 (BLOC-1) govern the formation, stability and functions of recycling endosomal tubules. Endosomal PI4P production by type II PI4-kinases is needed to form nascent curved tubules through binding of BLOC-1 that stabilize and elongate them. Membrane remodeling by the PI4P/ BLOC-1 module functions not only in the recycling of endosomal cargoes, but also in the lifecycles of intracellular pathogens such as Chlamydia bacteria and influenza virus. This study demonstrates how a phospholipid and a protein complex coordinate as a minimal machinery to remodel cellular membranes into functional tubes.