Only three biological pathways are known to produce oxygen: photosynthesis, chlorate respiration and the detoxification of reactive oxygen species. Here we present evidence for a fourth pathway, possibly of considerable geochemical and evolutionary importance. The pathway was discovered after metagenomic sequencing of an enrichment culture that couples anaerobic oxidation of methane with the reduction of nitrite to dinitrogen. The complete genome of the dominant bacterium, named ‘Candidatus Methylomirabilis oxyfera’, was assembled. This apparently anaerobic, denitrifying bacterium encoded, transcribed and expressed the well-established aerobic pathway for methane oxidation, whereas it lacked known genes for dinitrogen production. Subsequent isotopic labelling indicated that ‘M. oxyfera’ bypassed the denitrification intermediate nitrous oxide by the conversion of two nitric oxide molecules to dinitrogen and oxygen, which was used to oxidize methane. These results extend our understanding of hydrocarbon degradation under anoxic conditions and explain the biochemical mechanism of a poorly understood freshwater methane sink. Because nitrogen oxides were already present on early Earth, our finding opens up the possibility that oxygen was available to microbial metabolism before the evolution of oxygenic photosynthesis. A previously unknown pathway producing oxygen during anaerobic methane oxidation linked to nitrite and nitrate reduction has been found in microbes isolated from freshwater sediments in Dutch drainage ditches. The complete genome of the bacterium responsible for this reaction has been assembled, and found to contain genes for aerobic methane oxidation. The bacterium reduces nitrite via the recombination of two molecules of nitric oxide into nitrogen and oxygen, bypassing the familiar denitrification intermediate nitrous oxide. This discovery is relevant to nitrogen and methane cycling in the environment and, since nitrogen oxides arose early on Earth, raises the possibility that oxygen was available to microbes before the advent of oxygen-producing photosynthesis. In certain microbes, the anaerobic oxidation of methane can be linked to the reduction of nitrates and nitrites. Here it is shown that this occurs through the intermediate production of oxygen. This brings the number of known biological pathways for oxygen production to four, with implications for our understanding of life on the early Earth.

Summary

 Mitochondrial complex I is the largest integral membrane enzyme of the respiratory chain and consists of 44 different subunits encoded in the mitochondrial and nuclear genome. Its biosynthesis is a highly complicated and multifaceted process involving at least 14 additional assembly factors. How these subunits assemble into a functional complex I and where the assembly factors come into play is largely unknown. Here, we applied a dynamic complexome profiling approach to elucidate the assembly of human mitochondrial complex I and its further incorporation into respiratory chain supercomplexes. We delineate the stepwise incorporation of all but one subunit into a series of distinct assembly intermediates and their association with known and putative assembly factors, which had not been implicated in this process before. The resulting detailed and comprehensive model of complex I assembly is fully consistent with recent structural data and the remarkable modular architecture of this multiprotein complex.

Abstract The human plasma glycoproteome holds enormous potential to identify personalized biomarkers to diagnose and understand disease. Recent advances in mass spectrometry and software development are opening novel avenues to mine the glycoproteome for protein- and site-specific glycosylation changes. Here, we describe a novel plasma N-glycoproteomics method for disease diagnosis and evaluated its clinical applicability by performing comparative glycoproteomics in blood plasma of 40 controls and a cohort of 74 patients with 13 different genetic diseases that directly impact the protein N-glycosylation pathway. The plasma glycoproteome yielded high-specificity biomarker signatures for each of the individual genetic defects. Bioinformatic analyses revealed site-specific glycosylation differences that could be explained by underlying glycobiology and in specific diseases by protein-intrinsic factors. Our work illustrates the strong potential of plasma glycoproteomics to significantly increase specificity of glycoprotein biomarkers with direct insights in site-specific glycosylation changes to better understand the mechanisms underlying human disease.

Abstract Real-time database searching allows for simpler and automated proteomics workflows as it eliminates technical bottlenecks in high throughput experiments. Most importantly, it enables results dependent acquisition (RDA) where search results can be used to guide data acquisition during acquisition. This is especially beneficial for glycoproteomics since the wide range of physicochemical properties of glycopeptides lead to a wide range of optimal acquisition parameters. We established here the GlycoPaSER prototype by extending the Parallel Search Engine in Real-time (PaSER) functionality for real-time glycopeptide identification from fragmentation spectra. Glycopeptide fragmentation spectra were decomposed into peptide- and glycan-moiety spectra using common N-glycan fragments. Each moiety was subsequently identified by a specialized algorithm running in real-time. GlycoPaSER can keep up with the rate of data acquisition for real-time analysis with similar performance to other glycoproteomics software and produces results that are in line with literature reference data. The GlycoPaSER prototype presented here provides the first proof-of-concept for real-time glycopeptide identification that unlocks future development of RDA technology to transcend data acquisition.

ABSTRACT Multiple Myeloma (MM) is a plasma cell malignancy characterized by a monoclonal expansion of plasma cells that secrete a characteristic M-protein. This M-protein is crucial for diagnosis and monitoring of MM in the blood of patients. Recent evidence has emerged suggesting that N-glycosylation of the M-protein variable (Fab) region contributes to M-protein pathogenicity, and that it is a risk factor for disease progression of plasma cell disorders. Current methodologies lack the specificity to provide a site-specific glycoprofile of the Fab regions of M-proteins. Here, we introduce a novel glycoproteogenomics method that allows detailed M-protein glycoprofiling by integrating patient specific Fab region sequences (genomics) with glycoprofiling by glycoproteomics. Genomic analysis uncovered a more than two-fold increase in the Fab Light Chain N-glycosylation of M-proteins of patients with Multiple Myeloma compared to Fab Light Chain N-glycosylation of polyclonal antibodies from healthy individuals. Subsequent glycoproteogenomics analysis of 41 patients enrolled in the IFM 2009 clinical trial revealed that the majority of the Fab N-glycosylation sites were fully occupied with complex type glycans, distinguishable from Fc region glycans due to high levels of sialylation, fucosylation and bisecting structures. Together, glycoproteogenomics is a powerful tool to study de novo Fab N-glycosylation in plasma cell dyscrasias.

Abstract Objectives Minimal residual disease (MRD) status in multiple myeloma (MM) is an important prognostic biomarker. Personalized blood-based targeted mass spectrometry detecting M-proteins (MS-MRD) was shown to provide a sensitive and minimally invasive alternative to MRD-assessment in bone marrow. However, MS-MRD still comprises of manual steps that hamper upscaling of MS-MRD testing. Here, we introduce a proof-of-concept for a novel workflow using data independent acquisition-parallel accumulation and serial fragmentation (dia-PASEF) and automated data processing. Methods Using automated data processing of dia-PASEF measurements, we developed a workflow that identified unique targets from MM patient sera and personalized protein sequence databases. We generated patient-specific libraries linked to dia-PASEF methods and subsequently quantitated and reported M-protein concentrations in MM patient follow-up samples. Assay performance of parallel reaction monitoring (prm)-PASEF and dia-PASEF workflows were compared and we tested mixing patient intake sera for multiplexed target selection. Results No significant differences were observed in lowest detectable concentration, linearity, and slope coefficient when comparing prm-PASEF and dia-PASEF measurements of serial dilutions of patient sera. To improve assay development times, we tested multiplexing patient intake sera for target selection which resulted in the selection of identical clonotypic peptides for both simplex and multiplex dia-PASEF. Furthermore, assay development times improved up to 25× when measuring multiplexed samples for peptide selection compared to simplex. Conclusions Dia-PASEF technology combined with automated data processing and multiplexed target selection facilitated the development of a faster MS-MRD workflow which benefits upscaling and is an important step towards the clinical implementation of MS-MRD.

The human neural retina is a complex tissue with abundant alternative splicing and more than 10% of genetic variants linked to inherited retinal diseases (IRDs) alter splicing. Traditional short-read RNA-sequencing methods have been used for understanding retina-specific splicing but have limitations in detailing transcript isoforms. To address this, we generated a proteogenomic atlas that combines PacBio long-read RNA-sequencing data with mass spectrometry and whole genome sequencing data of three healthy human neural retina samples. We identified nearly 60,000 transcript isoforms, of which approximately one-third are novel. Additionally, ten novel peptides confirmed novel transcript isoforms. For instance, we identified a novel IMPDH1 isoform with a novel combination of known exons that is supported by peptide evidence. Our research underscores the potential of in-depth tissue-specific transcriptomic analysis to enhance our grasp of tissue-specific alternative splicing. The data underlying the proteogenomic atlas are available via EGA with identifier EGAD50000000101, via ProteomeXchange with identifier PXD045187, and accessible through the UCSC genome browser.

ABSTRACT Glycoproteins play important roles in numerous physiological processes and are often implicated in disease. Analysis of site-specific protein glycobiology through glycoproteomics is evolving rapidly in recent years thanks to hardware and software innovations. Particularly, the introduction of Parallel Accumulation Serial Fragmentation (PASEF) on hybrid trapped ion mobility time-of-flight mass spectrometry instruments combined deep proteome sequencing with separation of (near-)isobaric precursor ions or converging isotope envelopes through ion mobility separation. However, reported use of PASEF in integrated glycoproteomics workflows to comprehensively capture the glycoproteome is still limited. To this end, we developed an integrated methodology using the timsTOF Pro 2 to enhance N-glycopeptide identifications in complex mixtures. We systematically optimized the ion optics tuning, collision energies, mobility isolation width and the use of do-pant-enriched nitrogen gas (DEN). Thus, we obtained a marked increase in unique glycopeptide identification rates compared to standard proteomics settings showcasing our results on a large set of glycopeptides. With short liquid chromatography gradients of 30 minutes, we increased the number of unique N-glycopeptide identifications in human plasma samples from around 100 identifications under standard proteomics condition to up to 1500 with our optimized glycoproteomics approach, highlighting the need for tailored optimizations to obtain comprehensive data. Abstract Figure