The germinal center (GC) reaction is essential for the generation of the somatically hypermutated, high-affinity antibodies that mediate adaptive immunity. Entry into the GC is limited to a small number of B cell clones; however, the process by which this limited number of clones is selected is unclear. In this study, we demonstrate that low-affinity B cells intrinsically capable of seeding a GC reaction fail to expand and become activated in the presence of higher-affinity B cells even before GC coalescence. Live multiphoton imaging shows that selection is based on the amount of peptide–major histocompatibility complex (pMHC) presented to cognate T cells within clusters of responding B and T cells at the T–B border. We propose a model in which T cell help is restricted to the B cells with the highest amounts of pMHC, thus allowing for a dynamic affinity threshold to be imposed on antigen-binding B cells.

Abstract The protozoan parasite Trypanosoma brucei evades clearance by the host immune system through antigenic variation of its dense variant surface glycoprotein (VSG) coat, periodically “switching” expression of the VSG using a large genomic repertoire of VSG-encoding genes 1–6 . Studies of antigenic variation in vivo have focused near exclusively on parasites in the bloodstream 5,7,8 , but recent work has shown that many, if not most, parasites reside in the interstitial spaces of tissues 9–13 . We sought to explore the dynamics of antigenic variation in extravascular parasite populations using VSG-seq 7 , a high-throughput sequencing approach for profiling VSGs expressed in populations of T. brucei . Here we show that tissues, not the blood, are the primary reservoir of antigenic diversity during T. brucei infection, with more than 85% of VSGs found exclusively within extravascular spaces. We found that this increased diversity is correlated to slower parasite clearance in tissue spaces. Together, these data support a model in which the slower immune response in extravascular spaces provides more time to generate the antigenic diversity needed to maintain a chronic infection. Our findings reveal the important role that extravascular spaces can play in pathogen diversification.

Abstract Trypanosoma brucei gambiense is the primary causative agent of human African trypanosomiasis (HAT), a vector-borne disease endemic to West and Central Africa. The extracellular parasite evades antibody recognition within the host bloodstream by altering its Variant Surface Glycoprotein (VSG) coat through a process of antigenic variation. The serological tests which are widely used to screen for HAT use VSG as one of the target antigens. However, the VSGs expressed during human infection have not been characterized. Here we use VSG-seq to analyze the VSGs expressed in the blood of patients infected with T. b. gambiense and compared them to VSG expression in T. b. rhodesiense infections in humans as well as T. b. brucei infections in mice. The 44 VSGs expressed during T. b. gambiense infection revealed a striking bias towards expression of type B N-termini (82% of detected VSGs). This bias is specific to T. b. gambiense , which is unique among T. brucei subspecies in its chronic clinical presentation and anthroponotic nature, pointing towards a potential link between VSG expression and pathogenesis. The expressed T. b. gambiense VSGs also share very little similarity to sequences from 36 T. b. gambiense whole genome sequencing datasets, particularly in areas of the VSG protein exposed to host antibodies, suggesting that wild T. brucei VSG repertoires vary more than previously expected. Overall, this work demonstrates new features of antigenic variation in T. brucei gambiense and highlights the importance of understanding VSG repertoires in nature. Significance Statement Human African Trypanosomiasis is a neglected tropical disease primarily caused by the extracellular parasite Trypanosoma brucei gambiense . To avoid elimination by the host, these parasites repeatedly replace their Variant Surface Glycoprotein (VSG) coat. Despite the important role of VSGs in prolonging infection, VSG expression during human infections is poorly understood. A better understanding of natural VSG gene expression dynamics can clarify the mechanisms that T. brucei uses to alter its VSG coat and improve trypanosomiasis diagnosis in humans. We analyzed the expressed VSGs detected in the blood of patients with trypanosomiasis. Our findings indicate that there are features of antigenic variation unique to human-infective T. brucei subspecies and VSGs expressed in natural infection may vary more than previously expected.

Abstract Antigenic variation is an immune evasion strategy used by many different pathogens. It involves the periodic, non-random switch in the expression of different antigens throughout an infection. How the observed hierarchy in antigen expression is achieved has remained a mystery. A key challenge in uncovering this process has been the inability to track transcriptome changes and potential genomic rearrangements in individual cells during a switch event. Here, we report the establishment of a highly sensitive single-cell RNA-seq (scRNA-seq) approach for the model protozoan parasite Trypanosoma brucei . This approach has revealed genomic rearrangements that occur in individual cells during a switch event. Our data show that following a double-strand break (DSB) in the transcribed antigen-coding gene – an important trigger for antigen switching – the type of repair mechanism and the resultant antigen expression depend on the availability of a homologous repair template in the genome. When such a template was available, repair proceeded through segmental gene conversion, creating new, mosaic antigen-coding genes. Conversely, in the absence of a suitable template, a telomere-adjacent antigen-coding gene from a different part of the genome was activated by break-induced replication. Our results reveal the critical role of available repair sequence in the antigen selection mechanism. Additionally, our study demonstrates the power of highly sensitive scRNA-seq methods in detecting genomic rearrangements that drive transcriptional changes at the single-cell level.

Background: A growing body of evidence from animal models indicates that the myocardium hosts a population of B cells that play a role in the development of cardiomyopathy. However, there is minimal data on human myocardial B cells and their biological niche within the heart remains mostly unexplored. Methods: We integrated single-cell and single-nuclei datasets from 45 healthy human hearts, 70 hearts with dilated cardiomyopathy (DCM), and 8 hearts with Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy (ARVC). Interactions between B cells and other cell types were investigated using the CellChat Package. Differential gene expression analysis comparing B cells across conditions was performed using DESeq2. Pathway analysis was performed using Ingenuity, KEGG, and GO pathways analysis. Results: Out of 1,200,752 nuclei and 49,723 cells, we identified 1,100 B cells, including naive B cells and plasma cells. B cells showed an extensive network of interactions within the healthy myocardium that included outgoing signaling to macrophages, T cells, endothelial cells, and pericytes, and incoming signaling from endothelial cells, pericytes, and fibroblasts. This biological niche relied on both ECM-receptor interactions, cell-cell contact interactions, and paracrine interaction, it changed significantly in the context of cardiomyopathy and had disease-specific features. Differential gene expression analysis showed that in the context of DCM both naive and plasma myocardial B cells upregulated several pathways related to immune activation, including upregulation of oxidative phosphorylation, upregulation of leukocyte extravasation and, in naive B cells, antigen processing and presentation. Conclusions: The human healthy and diseased myocardium contains naive B cells and plasma cells, integrated in a diverse and dynamic biological niche. Naive myocardial-associated B cells likely contribute to the pathogenesis of human dilated cardiomyopathy.

Antigenic variation, using large genomic repertoires of antigen-encoding genes, allows pathogens to evade host antibody. Many pathogens, including the African trypanosome

ABSTRACT Trypanosoma brucei is a protozoan parasite that causes human and animal African trypanosomiases (HAT and AAT). Cardiac symptoms are commonly reported in HAT patients, and intracardiac parasites with accompanying myocarditis have been observed in both natural hosts and animal models of T. brucei infection. Despite the importance of T. brucei as a cause of cardiac dysfunction and the dramatic socioeconomic impact of African trypanosomiases in sub-Saharan Africa, there are currently no reproducible murine models of T. brucei- associated cardiomyopathy. We present the first clinically relevant, reproducible murine model of cardiac dysfunction in chronic T. brucei infection. Similar to humans, mice showed histological evidence of myocarditis and elevation of serum NT-proBNP with electrocardiographic abnormalities. Serum NT-proBNP levels were elevated prior to the development of severe ventricular dysfunction. On flow cytometry, myocarditis was associated with an increase of most myocardial immune cell populations, including multiple T cell and macrophage subsets, corroborating the notion that T. brucei- associated cardiac damage is an immune-mediated event. This novel mouse model represents a powerful and practical tool to investigate the pathogenesis of T. brucei -mediated heart damage and supports the development of therapeutic options for T. brucei -associated cardiac disease. In characterizing this model, we provide evidence that T. brucei causes cardiac disease, and we suggest that immunopathology is an important contributor to cardiac pathology. Along with other recent studies, our work demonstrates the importance of extravascular spaces, including the heart, for T. brucei pathogenesis. IMPORTANCE African trypanosomiasis is a neglected tropical disease affecting both people and cattle, which represents a major public health problem in sub-Saharan Africa with an enormous socioeconomic impact. Cardiac disease represents an underappreciated clinical manifestation of African trypanosomiasis that may lead to lifelong illness despite successful treatment of infection. However, this aspect of African trypanosomiasis remains poorly understood, partially due to a lack of well-characterized and practical animal models. In this study, we present the development and characterization of a novel, reproducible, and cost-effective mouse model of cardiac dysfunction in African trypanosomiasis. We demonstrate that this model recapitulates major features of cardiac dysfunction in natural infection, including the presence of parasites in the cardiac interstitial spaces, alterations of cardiac biomarkers, and functional changes. This model represents a resource to support the understanding of cardiac complications of trypanosomiasis and the development of new therapies to prevent and treat cardiac involvement in African trypanosomiasis.

Abstract Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, which causes 10,000 deaths per year. Despite the high mortality caused by the pathogen, relatively few parasite genomes have been assembled to date; even some commonly used laboratory strains do not have publicly available genome assemblies. This is at least partially due to T. cruzi’ s highly complex and highly repetitive genome: while describing the variation in genome content and structure is critical to better understanding T. cruzi biology and the mechanisms that underlie Chagas disease, the complexity of the genome defies investigation using traditional short read sequencing methods. Here, we have generated a high-quality whole genome assembly of the hybrid Tulahuen strain, a commercially available Type VI strain, using long read Nanopore sequencing without short read scaffolding. Using automated tools and manual curation for annotation, we report a genome with 25% repeat regions, 17% variable multigene family members, and 27% transposable elements. Notably, we find that regions with transposable elements are significantly enriched for surface proteins, and that on average surface proteins are closer to transposable elements compared to other coding regions. This finding supports a possible mechanism for diversification of surface proteins in which mobile genetic elements such as transposons facilitate recombination within the gene family. This work demonstrates the feasibility of nanopore sequencing to resolve complex regions of T. cruzi genomes, and with these resolved regions, provides support for a possible mechanism for genomic diversification.

Abstract Chagas disease, caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi , is a neglected parasitic disease that affects approximately 6 million individuals worldwide. Of those infected, 20-30% will go on to develop chronic Chagas cardiomyopathy (CCC), and ultimately many of these individuals will progress to advanced heart failure. The mechanism by which this progression occurs is poorly understood, as few studies have focused on early CCC. In this study, we sought to understand the physiologic changes associated with T. cruzi infection and the development of CCC. We analyzed gene expression in the peripheral blood of asymptomatic Chagas patients with early structural heart disease, Chagas patients without any signs or symptoms of disease, and Chagas-negative patients with and without early structural heart disease. Our analysis shows that early CCC was associated with a downregulation of various peripheral immune response genes, with gene expression changes suggestive of reduced antigen presentation and T cell activation. Notably, these genes and processes were distinct from those of early cardiomyopathy in Chagas-negative patients, suggesting that the processes mediating CCC may be unique from those mediating progression to other cardiomyopathies. This work highlights the importance of the immune response in early CCC, providing insight into the early pathogenesis of this disease. The changes we have identified may serve as biomarkers of progression and could inform strategies for the treatment of CCC in its early stages, before significant cardiac damage has occurred.