ABSTRACT Background Linking the identity of wild microbes with their ecophysiological traits and environmental functions is a key ambition for microbial ecologists. Of many techniques that strive to meet this goal, Stable Isotope Probing—SIP—remains the most comprehensive for studying whole microbial communities in situ . In DNA-SIP, active microorganisms that take up an isotopically heavy substrate build heavier DNA, which can be partitioned by density into multiple fractions and sequenced. However, SIP is relatively low throughput and requires significant hands-on labor. We designed and tested a semi-automated DNA-SIP pipeline to support well-replicated, temporally-resolved amplicon or metagenomics experiments that enable studies of dynamic microbial communities over space and time. To test this pipeline, we assembled SIP-metagenome assembled genomes (MAGs) from the hyphosphere zone surrounding arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), in combination with a 13 CO 2 plant labelling study. Results Our semi-automated pipeline for DNA fractionation, cleanup, and nucleic acid quantification of SIP density gradients requires six times less hands-on labor compared to manual SIP and allows 16 samples to be processed simultaneously. Automated density fractionation increased the reproducibility of SIP gradients and reduced variation compared to manual fractionation, and we show adding a non-ionic detergent to the gradient buffer improved SIP DNA recovery. We then tested this pipeline on samples from a highly-constrained soil microhabitat with significant ecological importance, the AMF fungal hyphosphere. Processing via our quantitative SIP pipeline confirmed the AMF Rhizophagus intraradices and its associated microbiome were highly 13 C enriched, even though the soils’ overall enrichment was only 1.8 atom% 13 C. We assembled 212 13 C-enriched hyphosphere MAGs, and the hyphosphere taxa that assimilated the most AMF-derived 13 C (range 10-33 atom%) were from the phlya Myxococcota, Fibrobacterota, Verrucomicrobiota, and the ammonia oxidizing archaeon genus Nitrososphaeara . Conclusions Our semi-automated SIP approach decreases operator time and errors and improves reproducibility by targeting the most labor-intensive steps of SIP—fraction collection and cleanup. Here, we illustrate this approach in a unique and understudied soil microhabitat—generating MAGs of active microbes living in the AMF hyphosphere (without plant roots). Their phylogenetic composition and gene content suggest predation, decomposition, and ammonia oxidation may be key processes in hyphosphere nutrient cycling.

A bstract Photosynthetic microalgae are responsible for 50% of the global atmospheric CO 2 fixation into organic matter and hold potential as a renewable bioenergy source. Their metabolic interactions with the surrounding microbial community (the algal microbiome) play critical roles in carbon cycling, but due to methodological limitations, it has been challenging to examine how community is developed by spatial proximity to their algal host. Here we introduce a hydrogel-based porous microplate to co-culture algae and bacteria, where metabolites are constantly exchanged between the microorganisms while maintaining physical separation. In the microplate we found that the diatom Phaeodactylum tricornutum accumulated to cell abundances ~20 folds higher than under normal batch conditions due to constant replenishment of nutrients through the hydrogel. We also demonstrate that algal-associated bacteria, both single isolates and complex communities, responded to inorganic nutrients away from their host as well as organic nutrients originating from the algae in a spatially predictable manner. These experimental findings coupled with a mathematical model suggest that host proximity and algal culture growth phase impact bacterial community development in a taxon-specific manner through organic and inorganic nutrient availability. Our novel system presents a useful tool to investigate universal metabolic interactions between microbes in aquatic ecosystems.

Abstract Drought disrupts soil microbial activity and many biogeochemical processes. Although plant-associated fungi can support plant performance and nutrient cycling during drought, their effects on nearby drought-exposed soil microbial communities are not well resolved. We used H 18 O quantitative stable isotope probing (qSIP) and 16S rRNA gene profiling to investigate bacterial community dynamics following water limitation in the hyphospheres of two distinct fungal lineages ( Rhizophagus irregularis and Serendipita bescii ) grown with the bioenergy model grass Panicum hallii . In uninoculated soil, a history of water limitation resulted in significantly lower bacterial growth potential and growth efficiency, as well as lower diversity in the actively growing bacterial community. In contrast, both fungal lineages had a protective effect on hyphosphere bacterial communities exposed to water limitation: bacterial growth potential, growth efficiency, and the diversity of the actively growing bacterial community were not suppressed by a history of water limitation in soils inoculated with either fungus. Despite their similar effects at the community level, the two fungal lineages did elicit different taxon-specific responses, and bacterial growth potential was greater in R. irregularis - compared in S. bescii - inoculated soils. Several of the bacterial taxa that responded positively to fungal inocula belong to lineages that are considered drought-susceptible. Overall, H 18 O qSIP highlighted treatment effects on bacterial community structure that were less pronounced using traditional 16S rRNA gene profiling. Together, these results indicate that fungal-bacterial synergies may support bacterial resilience to moisture limitation.