Abstract We present a unified conceptual framework and the associated software package for single molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) analysis from single photon arrivals leveraging Bayesian nonparametrics, BNP-FRET. This unified framework addresses the following key physical complexities of a single photon smFRET experiment, including: 1) fluorophore photophysics; 2) continuous time kinetics of the labeled system with large timescale separations between photophysical phenomena such as excited photophysical state lifetimes and events such as transition between system states; 3) unavoidable detector artefacts; 4) background emissions; 5) unknown number of system states; and 6) both continuous and pulsed illumination. These physical features necessarily demand a novel framework that extends beyond existing tools. In particular, the theory naturally brings us to a hidden Markov model (HMM) with a second order structure and Bayesian nonparametrics (BNP) on account of items 1, 2 and 5 on the list. In the second and third companion manuscripts, we discuss the direct effects of these key complexities on the inference of parameters for continuous and pulsed illumination, respectively. Why It Matters smFRET is a widely used technique for studying kinetics of molecular complexes. However, until now, smFRET data analysis methods required specifying a priori the dimensionality of the underlying physical model (the exact number of kinetic parameters). Such approaches are inherently limiting given the typically unknown number of physical configurations a molecular complex may assume. The methods presented here eliminate this requirement and allow estimating the physical model itself along with kinetic parameters, while incorporating all sources of noise in the data.

Abstract Förster resonance energy transfer (FRET) using pulsed illumination has been pivotal in leveraging lifetime information in FRET analysis. However, there remain major challenges in quantitative single photon, single molecule FRET (smFRET) data analysis under pulsed illumination including: 1) simultaneously deducing kinetics and number of system states; 2) providing uncertainties over estimates, particularly uncertainty over the number of system states; 3) taking into account detector noise sources such as crosstalk, and the instrument response function contributing to uncertainty; in addition to 4) other experimental noise sources such as background. Here, we implement the Bayesian nonparametric framework described in the first companion manuscript that addresses all aforementioned issues in smFRET data analysis specialized for the case of pulsed illumination. Furthermore, we apply our method to both synthetic as well as experimental data acquired using Holliday junctions. Why It Matters In the first companion manuscript of this series, we developed new methods to analyze noisy smFRET data. These methods eliminate the requirement of a priori specifying the dimensionality of the physical model describing a molecular complex’s kinetics. Here, we apply these methods to experimentally obtained datasets with samples illuminated by laser pulses at regular time intervals. In particular, we study conformational dynamics of Holliday junctions.

ABSTRACT Bdellovibrio bacteriovorus is a predatory bacterium that preys upon gram-negative bacteria. As such, B. bacteriovorus has the potential to control antibiotic-resistant pathogens and biofilm populations. To survive and reproduce, B. bacteriovorus must locate and infect a host cell. However, in the temporary absence of prey, it is largely unknown how B. bacteriovorus modulate their motility patterns in response to physical or chemical environmental cues to optimize their energy expenditure. To investigate B. bacteriovorus’ predation strategy, we track and quantify their motion by measuring speed distributions and velocity autocorrelations as a function of starvation time. An initial unimodal speed distribution, relaxing to that expected for pure diffusion at long times, may be expected. Instead, we observe a complex, non-Brownian, search strategy as evidenced by distinctly bimodal speed distributions. That is, for an increasing amount of time over which B. bacteriovorus is starved, we observe a progressive re-weighting from a fast mode to a slow mode in the speed distribution obtained over consecutive frames. By contrast to its predator, B. bacteriovorus’ prey, Escherichia coli exhibits almost immediate decrease to a speed expected from passive diffusion following resuspension from rich to poor media. Distributions of trajectory-averaged speeds for B. bacteriovorus are largely unimodal, indicating nontrivial switching between fast and slow swimming modes within individual observed trajectories rather than there being distinct fast and slow populations. We also find that B. bacteriovorus’ slow speed mode is not merely caused by the diffusion of inviable bacteria as subsequent spiking experiments show that bacteria can be resuscitated and bimodality restored. Indeed, starved B. bacteriovorus may modulate the frequency and duration of active swimming as a means of balancing energy consumption and procurement. Our results are evidence of a nontrivial predation strategy, which contrasts with the comparatively simple search pattern of its prey, in response to environmental cues. SIGNIFICANCE Bdellovibrio bacteriovorus is a predatory bacterium that is poised to help control gram-negative bacterial populations in environmental and clinical settings. In order to locate its prey in solution, B. bacteriovorus must expend energy in order to fight hydrodynamic drag. This raises the question as to how B. bacteriovorus should expend its energy reserves in the absence of chemical cues from its prey. Here, we show that B. bacteriovorus adapts its motility to minimize energy expenditure (due to fighting drag in swimming) upon prolonged starvation by exploiting two modes of motility. This is in sharp contrast to its prey, E. coli , which shows little active motility under starvation conditions.

ABSTRACT Potential energy landscapes are useful models in describing events such as protein folding and binding. While single molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) experiments encode information on continuous potentials for the system probed, including rarely visited barriers between putative potential minima, this information is rarely decoded from the data. This is because existing analysis methods often model smFRET output assuming, from the onset, that the system probed evolves in a discretized state-space to be analyzed within a Hidden Markov Model (HMM) paradigm. By contrast, here we infer continuous potentials from smFRET data without discretely approximating the state-space. We do so by operating within a Bayesian nonparametric paradigm by placing priors on the family of all possible potential curves. As our inference accounts for a number of required experimental features raising computational cost (such as incorporating discrete photon shot noise), the framework leverages a Structured-Kernel-Interpolation Gaussian Process prior to help curtail computational cost. We show that our Structured-Kernel-Interpolation Priors for Potential Energy Reconstruction from smFRET (SKIPPER-FRET) analysis accurately infers the potential energy landscape from a smFRET binding experiment. We then illustrate advantages of SKIPPER-FRET over standard HMM approaches by providing information, such as barrier heights and friction coefficients, otherwise inaccessible to HMMs. SIGNIFICANCE We introduce SKIPPER-FRET, a tool for inferring continuous potential energy landscapes, including barrier heights, from single molecule smFRET data. We benchmark on synthetic and experimental data.

Abstract Life’s fundamental processes involve multiple molecules operating in close proximity within cells. To probe the composition and kinetics of molecular clusters confined within small (diffraction-limited) regions, experiments often report on the total fluorescence intensity simultaneously emitted from labeled molecules confined to such regions. Methods exist to enumerate total fluorophore numbers (e.g., step counting by photobleaching). However, methods aimed at step counting by photobleaching cannot treat photophysical dynamics in counting nor learn their associated kinetic rates. Here we propose a method to simultaneously enumerate fluorophores and determine their individual photophysical state trajectories. As the number of active (fluorescent) molecules at any given time is unknown, we rely on Bayesian nonparametrics and use specialized Monte Carlo algorithms to derive our estimates. Our formulation is benchmarked on synthetic and real data sets. While our focus here is on photophysical dynamics (in which labels transition between active and inactive states), such dynamics can also serve as a proxy for other types of dynamics such as assembly and disassembly kinetics of clusters. Similarly, while we focus on the case where all labels are initially fluorescent, other regimes, more appropriate to photoactivated localization microscopy, where fluorophores are instantiated in a non-fluorescent state, fall within the scope of the framework. As such, we provide a complete and versatile framework for the interpretation of complex time traces arising from the simultaneous activity of up to 100 fluorophores.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS), is a flexible and widely used tool routinely exploited for in vivo and in vitro applications. While FCS provides estimates of dynamical quantities, such as diffusion coefficients, it demands high signal to noise ratios and long time traces, typically in the minute range. In principle, the same information can be extracted from µ -s long time traces; however, an appropriate analysis method is missing. To overcome these limitations, we adapt novel tools inspired by Bayesian non-parametrics, which starts from the direct analysis of the observed photon counts. With this approach, we are able to analyze time traces, which are too short to be analyzed by existing methods, including FCS. Our new analysis extends the capability of single molecule fluorescence confocal microscopy based approaches, to probe processes several orders of magnitude faster in time and permits a reduction of phototoxic effects on living samples induced by long periods of light exposure.

Abstract The hidden Markov model (HMM) is a framework for time series analysis widely applied to single molecule experiments. It has traditionally been used to interpret signals generated by systems, such as single molecules, evolving in a discrete state space observed at discrete time levels dictated by the data acquisition rate. Within the HMM framework, originally developed for applications outside the Natural Sciences, such as speech recognition, transitions between states, such as molecular conformational states, are modeled as occurring at the end of each data acquisition period and are described using transition probabilities. Yet, while measurements are often performed at discrete time levels in the Natural Sciences, physical systems evolve in continuous time according to transition rates. It then follows that the modeling assumptions underlying the HMM are justified if the transition rates of a physical process from state to state are small as compared to the data acquisition rate. In other words, HMMs apply to slow kinetics. The problem is, as the transition rates are unknown in principle, it is unclear, a priori , whether the HMM applies to a particular system. For this reason, we must generalize HMMs for physical systems, such as single molecules, as these switch between discrete states in continuous time . We do so by exploiting recent mathematical tools developed in the context of inferring Markov jump processes and propose the hidden Markov jump process (HMJP). We explicitly show in what limit the HMJP reduces to the HMM. Resolving the discrete time discrepancy of the HMM has clear implications: we no longer need to assume that processes, such as molecular events, must occur on timescales slower than data acquisition and can learn transition rates even if these are on the same timescale or otherwise exceed data acquisition rates.

Biological images captured by a microscope are characterized by heterogeneous signal-to-noise ratios (SNRs) across the field of view due to spatially varying photon emission and camera noise. State-of-the-art unsupervised structured illumination microscopy (SIM) reconstruction algorithms, commonly implemented in the Fourier domain, do not accurately model this noise and suffer from high-frequency artifacts, user-dependent choices of smoothness constraints making assumptions on biological features, and unphysical negative values in the recovered fluorescence intensity map. On the other hand, supervised methods rely on large datasets for training, and often require retraining for new sample structures. Consequently, achieving high contrast near the maximum theoretical resolution in an unsupervised, physically principled manner remains a challenging task. Here, we propose Bayesian-SIM (B-SIM), an unsupervised Bayesian framework to quantitatively reconstruct SIM data, rectifying these shortcomings by accurately incorporating all noise sources in the spatial domain. To accelerate the reconstruction process for computational feasibility, we devise a parallelized Monte Carlo sampling strategy for inference. We benchmark our framework on both simulated and experimental images, and demonstrate improved contrast permitting feature recovery at up to 25% shorter length scales over state-of-the-art methods at both high- and low-SNR. B-SIM enables unsupervised, quantitative, physically accurate reconstruction without the need for labeled training data, democratizing high-quality SIM reconstruction and expands the capabilities of live-cell SIM to lower SNR, potentially revealing biological features in previously inaccessible regimes.

Abstract Tracking single molecules continues to provide new insights into the fundamental rules governing biological function. Despite continued technical advances in fluorescent and non-fluorescent labeling as well as data analysis, direct observations of trajectories and interactions of multiple molecules in dense environments remain aspirational goals. While confocal methods provide a means to deduce dynamical parameters with high temporal resolution, such as diffusion coefficients, they do so at the expense of spatial resolution. Indeed, on account of a confocal volume’s symmetry, typically only distances from the center of the confocal spot can be deduced. Motivated by the need for true three dimensional high speed tracking in densely labeled environments, we propose a computational tool for tracking many fluorescent molecules traversing multiple, closely spaced, confocal measurement volumes providing independent observations. Various realizations of this multiple confocal volumes strategy have previously been used for long term, large area, tracking of one fluorescent molecule in three dimensions. What is more, we achieve tracking by directly using single photon arrival times to inform our likelihood and exploit Hamiltonian Monte Carlo to efficiently sample trajectories from our posterior within a Bayesian nonparametric paradigm. A nonparametric paradigm here is warranted as the number of molecules present are, themselves, a priori unknown. Taken together, we provide a computational framework to infer trajectories of multiple molecules at once, below the diffraction limit (the width of a confocal spot), in three dimensions at sub-millisecond or faster time scales.

Abstract Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) has become a standard tool in the quantitative analysis of sub-cellular environments. However, quantitative FLIM analyses face several challenges. First, spatial correlations between pixels are often ignored as signal from individual pixels is analyzed independently thereby limiting spatial resolution. Second, existing methods deduce photon ratios instead of absolute lifetime maps. Next, the number of lifetime components contributing to the signal is unknown, while excited state lifetimes with <1 ns difference are difficult to discriminate. Finally, existing analyses require high photon budgets, and often cannot rigorously propagate experimental uncertainty into values over lifetime maps and number of components involved. To overcome all of these challenges simultaneously and self-consistently at once, we propose the first doubly nonparametric framework. That is, we learn the number of fluorescent species (through beta-Bernoulli process priors) and absolute lifetime maps of these species (through Gaussian process priors) by leveraging information from pulses not leading to observed photon. We benchmark our algorithm using a broad range of synthetic and experimental data and demonstrate its robustness across a number of scenarios including cases where we recover lifetime differences between components as small as 0.3 ns with merely 1000 photons.