Abstract Biological membranes have a stunning ability to adapt their composition in response to physiological stress and metabolic challenges. Little is known how such perturbations affect individual organelles in eukaryotic cells. Pioneering work provided insights into the subcellular distribution of lipids, but the composition of the endoplasmic reticulum (ER) membrane, which also crucially regulates lipid metabolism and the unfolded protein response, remained insufficiently characterized. Here we describe a method for purifying organellar membranes from yeast, MemPrep. We demonstrate the purity of our ER preparations by quantitative proteomics and document the general utility of MemPrep by isolating vacuolar membranes. Quantitative lipidomics establishes the lipid composition of the ER and the vacuolar membrane. Our findings have important implications for understanding the role of lipids in membrane protein insertion, folding, and their sorting along the secretory pathway. Application of the combined preparative and analytical platform to acutely stressed cells reveals dynamic ER membrane remodeling and establishes molecular fingerprints of lipid bilayer stress.

The endoplasmic reticulum (ER) is a key organelle of membrane biogenesis and crucial for the folding of both membrane and secretory proteins. Stress sensors of the unfolded protein response (UPR) monitor the unfolded protein load in the ER and convey effector functions for the maintenance of ER homeostasis. More recently, it became clear that aberrant compositions of the ER membrane, referred to as lipid bilayer stress, are equally potent activators of the UPR with important implications in obesity and diabetes. How the distinct signals from lipid bilayer stress and proteotoxic stress are processed by the highly conserved UPR transducer Ire1 remains unknown. Here, we have generated a functional, cysteine-less variant of Ire1 and performed systematic cysteine crosslinking experiments to establish the transmembrane architecture of signaling-active clusters in native membranes. We show that the transmembrane helices of two neighboring Ire1 molecules adopt an X-shaped configuration and that this configuration is independent of the primary cause for ER stress. Based on these findings, we propose that different forms of stress converge in a single, signaling-active conformation of Ire1.