ABSTRACT A major challenge in vaccine development, especially against rapidly evolving viruses, is the ability to focus the immune response toward evolutionarily conserved antigenic regions to confer broad protection. For example, while many broadly neutralizing antibodies against influenza have been found to target the highly conserved stem region of hemagglutinin (HA-stem), the immune response to seasonal influenza vaccines is predominantly directed to the immunodominant but variable head region (HA-head), leading to narrow-spectrum efficacy. Here, we first introduce an approach to controlling antigen orientation based on the site-specific insertion of short stretches of aspartate residues (oligoD) that facilitates antigen-binding to alum adjuvants. We demonstrate the generalizability of this approach to antigens from the Ebola virus, SARS-CoV-2, and influenza and observe enhanced antibody responses following immunization in all cases. Next, we use this approach to reorient HA in an “upside down” configuration, which we envision increases HA-stem exposure, therefore also improving its immunogenicity compared to HA-head. When applied to HA of H2N2 A/Japan/305/1957, the reoriented H2 HA (reoH2HA) on alum induced a stem-directed antibody response that cross-reacted with both group 1 and 2 influenza A HAs. Our results demonstrate the possibility and benefits of antigen reorientation via oligoD insertion, which represents a generalizable immunofocusing approach readily applicable for designing epitope-focused vaccine candidates. GRAPHICAL ABSTRACT Seasonal influenza vaccines induce a biased antibody response against the variable head of hemagglutinin, whereas conserved epitopes on the stem are a target for universal vaccines. Here we show that reorienting HA in an “upside-down” configuration sterically occludes the head and redirects the antibody response to the more exposed stem, thereby inducing broad cross-reactivity against hemagglutinins from diverse influenza strains.

ABSTRACT There is an urgent need for point-of-care tuberculosis (TB) diagnostic methods that are fast, inexpensive, and operationally simple. Here, we report on a bright solvatochromic dye trehalose conjugate that specifically detects Mycobacterium tuberculosis (Mtb) in minutes. 3-hydroxychromone (3HC) dyes, known to yield high fluorescence quantum yields, exhibit shifts in fluorescence intensity in response to changes in environmental polarity. We synthesized two analogs of 3HC-trehalose conjugates (3HC-2-Tre and 3HC-3-Tre) and determined that 3HC-3-Tre has exceptionally favorable properties for Mtb detection. 3HC-3-Tre-labeled mycobacterial cells displayed a 10-fold increase in fluorescence intensity compared to our previously reports on the dye 4,4- N,N -dimethylaminonapthalimide (DMN-Tre). Excitingly, we detected fluorescent Mtb cells within 10 minutes of probe treatment. Thus, 3HC-3-Tre permits rapid visualization of mycobacteria that ultimately could empower improved Mtb detection at the point-of-care in low-resource settings.

ABSTRACT Ebola virus causes hemorrhagic fever in humans and poses a significant threat to global public health. Although two viral vector vaccines have been approved to prevent Ebola virus disease, they are distributed in the limited ring vaccination setting and only indicated for prevention of infection from orthoebolavirus zairense (EBOV) – one of three orthoebolavirus species that have caused previous outbreaks. Ebola virus glycoprotein GP mediates viral infection and serves as the primary target of neutralizing antibodies. Here we describe a universal Ebola virus vaccine approach using structure-guided design of candidates with hyperglycosylation that aims to direct antibody responses away from variable regions and toward conserved epitopes of GP. We first determined the hyperglycosylation landscape on Ebola virus GP and used that to generate hyperglycosylated GP variants with two to four additional glycosylation sites to mask the highly variable glycan cap region. We then created vaccine candidates by displaying wild-type or hyperglycosylated GP variants on ferritin nanoparticles (Fer). Immunization with these antigens elicited potent neutralizing antisera against EBOV in mice. Importantly, we observed consistent cross-neutralizing activity against Bundibugyo virus and Sudan virus from hyperglycosylated GP-Fer with two or three additional glycans. In comparison, elicitation of cross-neutralizing antisera was rare in mice immunized with wild-type GP-Fer. These results demonstrate a potential strategy to develop universal Ebola virus vaccines that confer cross-protective immunity against existing and emerging filovirus species. SIGNIFICANCE STATEMENT Ebola virus outbreaks cause hemorrhagic fever with high mortality rates. Current viral vaccines require cold-chain storage and are distributed in limited ring vaccination settings. They are only indicated for protection against orthoebolavirus zairense (EBOV), one of three human-pathogenic Ebola virus species. Here we harness hyperglycosylation as an immunofocusing approach to design universal Ebola virus vaccine candidates based on Ebola virus glycoprotein (GP) displayed on ferritin nanoparticles (Fer). Compared with wild-type GP-Fer, immunization with hyperglycosylated GP-Fer elicited potently neutralizing antisera against EBOV, and more importantly, consistent cross-neutralizing activity against the other two orthoebolavirus species. Our work shows that immunofocusing antibody responses toward conserved and neutralizing epitopes of GP represents a promising strategy for vaccine design against antigenically diverse Ebola virus species.

The threat of future coronavirus pandemics requires developing cost-effective vaccine technologies that provide broad and long-lasting protection against diverse circulating and emerging strains. Here we report a multivalent liposomal hydrogel depot vaccine technology comprising the receptor binding domain (RBD) of up to four relevant SARS and MERS coronavirus strains non-covalently displayed on the surface of the liposomes within the hydrogel structure. The multivalent presentation and sustained exposure of RBD antigens improved the potency, neutralizing activity, durability, and consistency of antibody responses across homologous and heterologous coronavirus strains in a naive murine model. When administrated in animals previously exposed to the wild-type SARS-CoV-2 antigens, liposomal hydrogels elicited durable antibody responses against the homologous SARS and MERS strains for over 6 months and elicited neutralizing activity against the immune-evasive SARS-CoV-2 variant Omicron BA.4/BA.5. Overall, the tunable antigen-decorated liposomal hydrogel platform we report here generates robust and durable humoral responses across diverse coronaviruses, supporting global efforts to effectively respond to future viral outbreaks.

Abstract Messenger RNA (mRNA) delivered in lipid nanoparticles (LNPs) rose to the forefront of vaccine candidates during the COVID-19 pandemic due in part to scalability, adaptability, and potency. Yet there remain critical areas for improvements of these vaccines in durability and breadth of humoral responses. In this work, we explore a modular strategy to target mRNA/LNPs to antigen presenting cells with an injectable polymer-nanoparticle (PNP) hydrogel depot technology which recruits key immune cells and forms an immunological niche in vivo. We characterize this niche on a single cell level and find it is highly tunable through incorporation of adjuvants like MPLAs and 3M-052. Delivering commercially available SARS-CoV-2 mRNA vaccines in PNP hydrogels improves the durability and quality of germinal center reactions, and the magnitude, breadth, and durability of humoral responses. The tunable immune niche formed within PNP hydrogels effectively skews immune responses based on encapsulated adjuvants, creating opportunities to precisely modulate mRNA/LNP vaccines for various indications from infectious diseases to cancers.