Polysaccharide Breakdown One of the current challenges in the biofuels industry is achieving efficient bioconversion of complex polysaccharides like cellulose and chitin. Recently, chitin-binding proteins (CBPs) have been identified that potentiate chitin hydrolysis. Now, Vaaje-Kolstad et al. (p. 219 ) show that a CBP from the chitinolytic bacterium Serratia marcescens appears to catalyze an oxygenase reaction on the surface of crystallized chitin, leading to chain breakage and generating oxidized ends that can be degraded by chitinases. A structurally similar enzyme, GH61, may play a similar role in the degradation of cellulose.

Abstract The bulk terrestrial biomass resource in a future bio-economy will be lignocellulosic biomass, which is recalcitrant and challenging to process. Enzymatic conversion of polysaccharides in the lignocellulosic biomass will be a key technology in future biorefineries and this technology is currently the subject of intensive research. We describe recent developments in enzyme technology for conversion of cellulose, the most abundant, homogeneous and recalcitrant polysaccharide in lignocellulosic biomass. In particular, we focus on a recently discovered new type of enzymes currently classified as CBM33 and GH61 that catalyze oxidative cleavage of polysaccharides. These enzymes promote the efficiency of classical hydrolytic enzymes (cellulases) by acting on the surfaces of the insoluble substrate, where they introduce chain breaks in the polysaccharide chains, without the need of first “extracting” these chains from their crystalline matrix.

Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) catalyze the oxidative cleavage of polysaccharides. Identification of a hydrogen peroxide–dependent pathway for sugar oxidation by these enzymes challenges the prevailing model that LPMOs are oxygen-dependent monooxygenases. Enzymes currently known as lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) play an important role in the conversion of recalcitrant polysaccharides, but their mode of action has remained largely enigmatic. It is generally believed that catalysis by LPMOs requires molecular oxygen and a reductant that delivers two electrons per catalytic cycle. Using enzyme assays, mass spectrometry and experiments with labeled oxygen atoms, we show here that H2O2, rather than O2, is the preferred co-substrate of LPMOs. By controlling H2O2 supply, stable reaction kinetics are achieved, the LPMOs work in the absence of O2, and the reductant is consumed in priming rather than in stoichiometric amounts. The use of H2O2 by a monocopper enzyme that is otherwise cofactor-free offers new perspectives regarding the mode of action of copper enzymes. Furthermore, these findings have implications for the enzymatic conversion of biomass in Nature and in industrial biorefining.

Significance Plant cell walls are recalcitrant copolymeric structures mainly comprising polysaccharides and lignin. Enzymatic degradation of the polysaccharides is a crucial step in biorefining of biomass. Recently, it was discovered that nature employs copper-dependent redox enzymes called lytic polysaccharide monoxoygenases (LPMOs) to promote degradation of the most recalcitrant and crystalline of these polysaccharides, cellulose. By carrying out oxidative cleavage of otherwise inaccessible cellulose chains, LPMOs create access points for classical hydrolytic enzymes such as cellulases. Intriguingly, the genomes of biomass degrading microorganisms encode a plethora of LPMOs (up to over 40). To our knowledge, we demonstrate for the first time that LPMOs act on hemicelluloses. This finding dramatically widens the scope of LPMOs and oxidative processes in plant cell wall degradation and biorefining.

The Gram-negative soil bacterium Serratia marcescens uses three different family 18 chitinases to degrade chitin, an abundant insoluble carbohydrate polymer composed of β(1,4)-linked units of N-acetylglucosamine. We show that efficient chitin degradation additionally depends on the action of a small non-catalytic protein, CBP21, which binds to the insoluble crystalline substrate, leading to structural changes in the substrate and increased substrate accessibility. CBP21 strongly promoted hydrolysis of crystalline β-chitin by chitinases A and C, while it was essential for full degradation by chitinase B. CBP21 variants with single mutations on the largely polar binding surface lost their ability to promote chitin degradation, while retaining considerable affinity for the polymer. Thus, binding alone is not sufficient for CBP21 functionality, which seems to depend on specific, mostly polar interactions between the protein and crystalline chitin. This is the first time a secreted binding protein is shown to assist in the enzymatic degradation of an insoluble carbohydrate via non-hydrolytic disruption of the substrate. Interestingly, homologues of CBP21 occur in most chitin-degrading microorganisms, suggesting a general mechanism by which chitin-binding proteins enhance chitinolytic activity. Homologues also occur in chitinase-containing insect viruses, whose infectiousness is known to depend on chitinase efficiency. The Gram-negative soil bacterium Serratia marcescens uses three different family 18 chitinases to degrade chitin, an abundant insoluble carbohydrate polymer composed of β(1,4)-linked units of N-acetylglucosamine. We show that efficient chitin degradation additionally depends on the action of a small non-catalytic protein, CBP21, which binds to the insoluble crystalline substrate, leading to structural changes in the substrate and increased substrate accessibility. CBP21 strongly promoted hydrolysis of crystalline β-chitin by chitinases A and C, while it was essential for full degradation by chitinase B. CBP21 variants with single mutations on the largely polar binding surface lost their ability to promote chitin degradation, while retaining considerable affinity for the polymer. Thus, binding alone is not sufficient for CBP21 functionality, which seems to depend on specific, mostly polar interactions between the protein and crystalline chitin. This is the first time a secreted binding protein is shown to assist in the enzymatic degradation of an insoluble carbohydrate via non-hydrolytic disruption of the substrate. Interestingly, homologues of CBP21 occur in most chitin-degrading microorganisms, suggesting a general mechanism by which chitin-binding proteins enhance chitinolytic activity. Homologues also occur in chitinase-containing insect viruses, whose infectiousness is known to depend on chitinase efficiency. Chitinase's Little Helper Journal of Biological ChemistryVol. 280Issue 31PreviewMore than one billion tons of chitin are produced by insects, fungi, and marine organisms every year. Despite this abundant production, chitin does not accumulate in most ecosystems, indicating that the carbohydrate polymer is somehow degraded. Many aquatic and terrestrial microorganisms contain chitinases, which are responsible for breaking down chitin. For example, the Gram-negative soil bacterium Serratia marcescens produces three chitinases, ChiA, ChiB, and ChiC. In addition to these chitinases, S. Full-Text PDF Open Access Each year more than one billion tons of chitin, a linear polymer of β(1–4)-linked N-acetylglucosamine, is produced in the biosphere, mainly by insects, fungi, crustaceans, and other marine organisms (1.Gooday G.W. Adv. Microb. Ecol. 1990; 11: 387-430Crossref Google Scholar). Like cellulose, chitin is an abundant insoluble linear polymer with considerable mechanical and chemical strength. Three crystalline forms of chitin have been described in terms of the arrangement of the chitin chains: α-chitin (chains run anti-parallel), β-chitin (chains run parallel), and γ-chitin (mixed parallel/antiparallel chains). Despite its resilience, insolubility, and abundant production, chitin does not accumulate in most ecosystems, suggesting that nature has developed efficient processes for chitin degradation. Chitin is degraded by chitinases (EC 3.2.1.14) that belong to families 18 and 19 of the glycoside hydrolases (Refs. 2.Henrissat B. Biochem. J. 1991; 280: 309-316Crossref PubMed Scopus (2651) Google Scholar and 3.Henrissat B. Davies G. Curr. Opin. Struct. Biol. 1997; 7: 637-644Crossref PubMed Scopus (1416) Google Scholar; afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). Chitinolytic enzymes have been detected in many microorganisms in both terrestrial and aquatic ecosystems. For example, the Gram-negative soil bacterium Serratia marcescens, known as one of the most effective microbial chitin degraders (4.Monreal J. Reese E.T. Can. J. Microbiol. 1969; 15: 689-696Crossref PubMed Scopus (456) Google Scholar), produces three family 18 chitinases, ChiA, ChiB, and ChiC (5.Fuchs R.L. Mcpherson S.A. Drahos D.J. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 51: 504-509Crossref PubMed Google Scholar, 6.Brurberg M.B. Eijsink V.G.H. Nes I.F. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 124: 399-404Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 7.Brurberg M.B. Eijsink V.G.H. Haandrikman A.J. Venema G. Nes I.F. Microbiology-UK. 1995; 141: 123-131Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar, 8.Suzuki K. Sugawara N. Suzuki M. Uchiyama T. Katouno F. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002; 66: 1075-1083Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar). Like cellulases (9.Boraston A.B. Bolam D.N. Gilbert H.J. Davies G.J. Biochem. J. 2004; 382: 769-781Crossref PubMed Scopus (1537) Google Scholar, 10.Gilbert H.J. Bolam D.N. Szabo L. Xie H. Williamson P.M. Simpson P.J. Jamal S. Boraston A.B. Kilburn D.G. Warren R.A.J. Teeri T.T. Svensson B. Gilbert H.J. Feizi T. Carbohydrate Bioengineering: Interdisciplinary Approaches. Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK2002: 89-98Google Scholar), chitinases, including ChiA, ChiB, and ChiC, often contain one or more non-catalytic domains that are known to help in binding and degrading the insoluble substrate (11.Suzuki K. Taiyoji M. Sugawara N. Nikaidou N. Henrissat B. Watanabe T. Biochem. J. 1999; 343: 587-596Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar, 12.Uchiyama T. Katouno F. Nikaidou N. Nonaka T. Sugiyama J. Watanabe T. J. Biol. Chem. 2001; 276: 41343-41349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (159) Google Scholar, 13.Watanabe T. Ito Y. Yamada T. Hashimoto M. Sekine S. Tanaka H. J. Bacteriol. 1994; 176: 4465-4472Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar, 14.Katouno F. Taguchi M. Sakurai K. Uchiyama T. Nikaidou N. Nonaka T. Sugiyama J. Watanabe T. J. Biochem. (Tokyo). 2004; 136: 163-168Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). Such domains are often referred to as carbohydrate-binding modules (CBMs) 1The abbreviations used are: CBM, carbohydrate-binding module; CBP, chitin-binding protein. and have been classified in the CAZY data base (afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). In addition to being important for biomass turnover, chitin degradation is essential in a variety of biological processes. For example, plants are known to produce chitinases in response to attack by chitin-containing fungi (15.Kasprzewska A. Cell. Mol. Biol. Lett. 2003; 8: 809-824PubMed Google Scholar), whereas some non-pathogenic fungi such as Trichoderma species are considered as “biocontrol” agents because of their ability to inhibit other, chitin-containing, fungi (16.Harman G.E. Howell C.R. Viterbo A. Chet I. Lorito M. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2: 43-56Crossref PubMed Scopus (2446) Google Scholar). While chitin-containing organisms may be inhibited by exogenous chitinolytic activity, they do need some endogenous chitin turnover as part of morphological and developmental processes (17.Kuranda M.J. Robbins P.W. J. Biol. Chem. 1991; 266: 19758-19767Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The malaria parasite Plasmodium falciparum needs family 18 chitinases to cross the chitinous peritrophic matrix of the mosquito host (18.Vinetz J.M. Dave S.K. Specht C.A. Brameld K.A. Xu B. Hayward R. Fidock D.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14061-14066Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar). Analogous processes are thought to occur in other protozoan parasites, e.g. Leishmania (19.Schlein Y. Jacobson R.L. Messer G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 9944-9948Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). A final example concerns insect viruses, which produce chitinases to disintegrate the peritrophic matrix of their target organism, thereby increasing virus infectiousness (20.Hawtin R.E. Zarkowska T. Arnold K. Thomas C.J. Gooday G.W. King L.A. Kuzio J.A. Possee R.D. Virology. 1997; 238: 243-253Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). In addition to three chitinases, S. marcescens secretes a 18.8-kDa protein, CBP21, when grown on chitin (21.Suzuki K. Suzuki M. Taiyoji M. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 128-135Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar). This protein belongs to CBM family 33 and is known to bind to β-chitin (21.Suzuki K. Suzuki M. Taiyoji M. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 128-135Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar). Its three-dimensional structure has recently been solved (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar). Homologues of the cbp21 gene can be found in the genomes of most microorganisms which possess chitinase genes. Chitin binding has been demonstrated for a few of these homologues (21.Suzuki K. Suzuki M. Taiyoji M. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 128-135Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 23.Folders J. Tommassen J. van Loon L.C. Bitter W. J. Bacteriol. 2000; 182: 1257-1263Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 24.Chu H.H. Hoang V. Hofemeister J. Schrempf H. Microbiology. 2001; 147: 1793-1803Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar, 25.Schnellmann J. Zeltins A. Blaak H. Schrempf H. Mol. Microbiol. 1994; 13: 807-819Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 26.Kolbe S. Fischer S. Becirevic A. Hinz P. Schrempf H. Microbiology-UK. 1998; 144: 1291-1297Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar), including a study showing that binding is not limited to the surface, but also involves intrusion into the chitin structure (27.Zeltins A. Schrempf H. Anal. Biochem. 1995; 231: 287-294Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar). Homologues also occur in insect viruses (named GP37 or fusolin proteins in baculoviruses and entomopoxviruses, respectively; see Ref. 28.Dall D. Luque T. O'Reilly D. Bioessays. 2001; 23: 184-193Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar and the references therein). It is known that these virus homologues are important for infectiousness (29.Mitsuhashi W. Furuta Y. Sato M. J. Invertebr. Pathol. 1998; 71: 186-188Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 30.Hukuhara T. Hayakawa T. Wijonarko A. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 1122-1124Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 31.Xu J.H. Hukuhara T. J. Invertebr. Pathol. 1992; 60: 259-264Crossref Scopus (39) Google Scholar, 32.Xu J.H. Hukuhara T. J. Invertebr. Pathol. 1994; 63: 14-18Crossref Scopus (22) Google Scholar), and in one case chitin binding has been demonstrated (33.Li Z.F. Li C.B. Yang K. Wang L.H. Yin C. Gong Y.X. Pang Y. Virus Res. 2003; 96: 113-122Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar). Currently, the precise biological function of CBP21-like microbial and virus proteins is not clear, but it has been hypothesized that they may play a role in microbial attachment to chitin or to enhance substrate availability by disruption of crystalline chitin (25.Schnellmann J. Zeltins A. Blaak H. Schrempf H. Mol. Microbiol. 1994; 13: 807-819Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). Auxiliary CBMs in cellulases (34.Gao P.J. Chen G.J. Wang T.H. Zhang Y.S. Liu J. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2001; 33: 13-18PubMed Google Scholar, 35.Din N. Gilkes N.R. Tekant B. Miller R.C. Warren A.J. Kilburn D.G. Biotechnology. 1991; 9: 1096-1099Crossref Scopus (257) Google Scholar, 36.Din N. Damude H.G. Gilkes N.R. Miller Jr., R.C. Warren R.A. Kilburn D.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 11383-11387Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 37.Saloheimo M. Paloheimo M. Hakola S. Pere J. Swanson B. Nyyssonen E. Bhatia A. Ward M. Penttila M. Eur. J. Biochem. 2002; 269: 4202-4211Crossref PubMed Scopus (346) Google Scholar) and amylases (38.Southall S.M. Simpson P.J. Gilbert H.J. Williamson G. Williamson M.P. FEBS Lett. 1999; 447: 58-60Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar) have also been suggested to work at least in part by disrupting substrate structure, but experimental evidence in support of this hypothesis is scarce. In contrast to the majority of the CBMs, which use solvent exposed aromatic residues to interact with substrates, CBP21 lacks an aromatic surface region (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar), and the mode of CBP21 substrate binding is not known. Here, we show that binding of CBP21 to chitin leads to disruption of the crystalline substrate structure and to a dramatic increase in chitinase efficiency. We show that CBP21 exerts this effect through specific polar interactions, which are not only important for binding, but also for alteration of the substrate structure. The implications of these findings for microbial chitin degradation and the potential roles of CBP21-like proteins in insect viruses are discussed. Apart from providing new insights into natural chitin degradation, the results also indicate ways to improve already established methods in e.g. plant disease control, which are based on the action of chitinolytic enzymes. Protein Expression and Purification—ChiA (6.Brurberg M.B. Eijsink V.G.H. Nes I.F. FEMS Microbiol. Lett. 1994; 124: 399-404Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar), ChiB (7.Brurberg M.B. Eijsink V.G.H. Haandrikman A.J. Venema G. Nes I.F. Microbiology-UK. 1995; 141: 123-131Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar), and ChiC 2B. Synstad, S. J. Horn, G. Vaaje-Kolstad, and V. G. H. Eijsink, manuscript in preparation. (Synstad et al., GenBank™ accession number AJ630582) from S. marcescens BJL200 were overexpressed in Escherichia coli and purified from periplasmic extracts (39.Brurberg M.B. Nes I.F. Eijsink V.G.H. Microbiology-UK. 1996; 142: 1581-1589Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar) using a two-step procedure. The first step consisted of standard ion-exchange chromatography using Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) at pH 9.4 to separate the chitinases from the majority of proteins in the periplasmic extracts. The second step consisted of hydrophobic interaction chromatography using a phenyl superpose 5/5 column (Amersham Biosciences), as described elsewhere (39.Brurberg M.B. Nes I.F. Eijsink V.G.H. Microbiology-UK. 1996; 142: 1581-1589Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar). His-tagged ChiG from Streptomyces coelicolor A3 (2.Henrissat B. Biochem. J. 1991; 280: 309-316Crossref PubMed Scopus (2651) Google Scholar) (GenBank™ accession number AB017013) was cloned behind a T7 promoter into the pETM11 (Günter Stier, EMBL, Heidelberg, Germany) expression vector. The protein was produced in isopropyl β-d-thiogalactopyranoside-induced E. coli BL21 DE3 cells, cells were lysed by sonication, and the protein was purified using a nickel column (5 × 2 cm, Qiagen), under standard conditions. All proteins were dialyzed into 20 mm Tris-HCl, pH 8.0, before use and stored at 4 °C. Wild type CBP21 and the CBP21 mutants were produced and purified as described previously (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar). Scanning Electron Microscopy—A 0.1 mg/ml β-chitin (France Chitin, Marseille) suspension in 50 μm phosphate buffer, pH 6.3, was preincubated for 48 h at 37 °C in Eppendorf tubes with either 0.1 mg/ml bovine serum albumin or 0.1 mg/ml bovine serum albumin and 0.1 mg/ml CBP21, applied onto an object glass (10 mm; 25 μl drops), and dried at 37 °C to fix the sample. The object glasses containing the samples were glued onto scanning electron microscopy aluminum studs with carbon tape and sputter-coated with gold-palladium. Scanning was performed in a JEOL JSM 6400 scanning electron microscope at 5 kV. Chitin Degradation Assays—Determination of chitinolytic activity was done using β-chitin from a squid pen (France Chitin), α-chitin isolated from shrimp shells (Hov-Bio, Tromsø, Norway), or crab shells (Sigma) or microparticulate β-chitin (Seikagaku Corp.) as substrate. Standard reaction mixtures contained varying concentrations of chitinase and CBP21, 0.1 mg/ml purified bovine serum albumin, 0.1 mg/ml chitin powder (unless stated otherwise), in 50 mm sodium phosphate buffer, pH 6.3. Reaction mixtures were incubated at 37 °C for up to 2 weeks. No agitation was used since the insoluble substrate easily adheres to the dry inner walls of the Eppendorf tubes, which would affect the substrate concentration. At time points ranging from 2 to 400 h, 60 μl of the reaction mixture was transferred to an Eppendorf tube containing 60 μl of 70% acetonitrile, to stop the reaction. Before taking samples, reaction mixtures were resuspended by gentle pipetting to leave the chitin concentration unaltered. All reactions were run in triplicate and all samples were stored at -20 °C until further analysis. Samples were analyzed by isocratic high performance liquid chromatography using an Amide-80 column (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA), coupled to a Gilson Unipoint high performance liquid chromatography system (Gilson). The liquid phase consisted of 70% acetonitrile, with a flow rate of 0.7 ml/min. 20-μl samples were injected using a Gilson 123 autoinjector. Eluted oligosaccharides were monitored by recording absorption at 210 nm. Chromatograms were collected and analyzed using the Gilson Unipoint software (Gilson). Since in all cases (GlcNAc)2 represented more than 95% of the total amount of degradation products on a molar basis, only (GlcNAc)2 peaks were subject for data analysis and used for quantification of the extent of chitin degradation. A standard solution containing 0.25 mm (GlcNAc)2 was analyzed at the start, in the middle, and at the end of each series of samples, and the resulting average value (displaying standard deviations of less than 3%) was used for calibration. Scanning Electron Microscopy of β-Chitin Fragments—Fig. 1 shows scanning electron micrographs of untreated and CBP21-treated β-chitin particles. The edges and surfaces of the untreated particles are discrete in shape, with smooth surfaces (Fig. 1, A, B, E, and F). In contrast, the edges and surfaces of the CBP21-treated particles showed an amorphous and porous character (Fig. 1, C and G), along with areas of disassembled chitin fibrils (Fig. 1, D and H). Degradation of β-Chitin with Different Chitinases—Degradation of β-chitin with the family 18 chitinases ChiA, ChiB, or ChiC showed biphasic kinetics, with an initial fast linear phase, followed by a slower, hyperbolic phase (Fig. 2, A–C). Initial degradation rates were determined by linear regression, whereas the hyperbolic second phase only allowed end point analysis as a rate descriptor (Table I). In the absence of CBP21 ChiA and ChiC had similar activities toward chitin, both in terms of initial rate and the time needed to fully degrade the substrate (tfull), whereas ChiB displayed a ∼3-fold slower initial rate and never managed to fully digest the substrate (Fig. 2, Table I). The addition of CBP21 had only minor effects on the initial rates but large effects on the slower second phase (that is, on tfull). For ChiA and ChiC tfull decreased ∼7-fold, whereas for ChiB addition of CBP21 led to complete degradation of the substrate, albeit still at a slower rate than in the case of ChiA and ChiC (Table I).Table IInitial rates (calculated for the first four time points: 2, 4, 6, and 8 h) and reaction end points (tfull)for the degradation of β -chitin with 0.2 μm ChiA, ChiB, or ChiC, in the absence or presence of CBP21 The R-square values from the linear regression analyses are indicated in brackets. The data are derived from the curves shown in Fig. 2. ND, not determined.ChitinaseInitial rateEnd point (tfull)–CBP21+CBP21–CBP21+CBP21mm (GlcNAc)2/hhChiA2.7 (0.95)3.4 (0.98)∼360∼48ChiB0.9 (0.98)1.3 (0.99)ND∼200ChiC2.3 (0.93)3.3 (0.99)∼360∼48 Open table in a new tab To verify that the enzymes remained active during the reactions, a series of experiments were carried out, in which CBP21 was added after 48-h preincubation with the chitinases. Fig. 2 shows that addition of CBP21 increased reaction rates to levels comparable to those observed in reactions where the CBP21 was present from t = 0. In an additional control experiment with ChiB, CBP21 was added after 216 h, which led to full degradation of the substrate (Fig. 2B). Control reactions containing CBP21 without enzyme did not yield detectable amounts of soluble chitooligosaccharides. Taken together, these results demonstrate that CBP21 facilitates the degradation of β-chitin by family 18 chitinases in a non-enzymatic manner. To investigate whether the effects of CBP21 on the efficiency of family 18 chitinases from S. marcescens were due to specific enzyme-CBP21 interactions, we also conducted experiments with ChiG, a family 19 chitinase from S. coelicolor. The results (Fig. 2D) show that CBP21 increased ChiG efficiency, suggesting that CBP21 has a general effect on substrate availability and does not act through specific interactions with particular enzymes. Dose-response studies of the effect of CBP21 on ChiC efficiency showed that ChiC displays maximum degradation rates at CBP21 concentrations ≥ 50 nm, regardless of the enzyme concentration (Fig. 3). Thus, the beneficial effect of CBP21 does not seem to be caused by a stoichiometric interaction with the enzyme. β-Chitin Degradation Using Combinations of ChiA, -B, and -C and CBP21—It is generally assumed that ChiA and ChiB are exochitinases, while ChiC is an endochitinase (8.Suzuki K. Sugawara N. Suzuki M. Uchiyama T. Katouno F. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002; 66: 1075-1083Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar, 40.Brurberg M.B. Synstad B. Klemsdal S.S. van Aalten D.M.F. Sundheim L. Eijsink V.G.H. Recent Res. Dev. Microbiol. 2001; 5: 187-204Google Scholar, 41.van Aalten D.M.F. Synstad B. Brurberg M.B. Hough E. Riise B.W. Eijsink V.G.H. Wierenga R.K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 5842-5847Crossref PubMed Scopus (244) Google Scholar), and synergistic effects between these enzymes have been observed in studies with colloidal chitin and α-chitin (8.Suzuki K. Sugawara N. Suzuki M. Uchiyama T. Katouno F. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002; 66: 1075-1083Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar, 39.Brurberg M.B. Nes I.F. Eijsink V.G.H. Microbiology-UK. 1996; 142: 1581-1589Crossref PubMed Scopus (216) Google Scholar). In agreement with previous experiments, Fig. 4 shows that the three S. marcescens chitinases act synergistically on β-chitin too. In all cases, CBP21 increased the degradation efficiency. The highest efficiency was obtained when combining all three enzymes in the presence of CBP21. Hydrolysis of β-Chitin with ChiC in the Presence of CBP21 Mutants—Combination of the structure of CBP21 with a multiple sequence alignment of bacterial CBPs has previously revealed conserved surface residues, whose mutation to alanine decreased chitin affinity 3–8-fold (Ref. 22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar; Fig. 5). These mutants, as well as two control CBP21 variants with wild type binding characteristics (A152R and Q161A (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar); Fig. 5), were used in hydrolysis studies with ChiC. Experiments with a CBP21 concentration of 50 nm, which gives maximum effects on ChiC efficiency in the case of wild type CBP21 (Fig. 3), showed that CBP21 mutants Y54A, E55A, E60A, H114A, and D182A had lost their functionality, while the N185A, A152R, and Q161A mutants showed wild type-like functionality (Fig. 6). The deleterious effects of the Y54A, E55A, and H114A mutations on CBP21 function were only slightly negated by increasing the CBP21 concentration as much as 100-fold (results not shown; E60A and D182A were not tested).Fig. 6Degradation of β-chitin by ChiC in the presence of CBP21 mutants. Degradation of 0.1 mg/ml β-chitin with 50 nm ChiC in the presence of 50 nm CBP21 wild-type (WT), Y54A, E55A, E60A, H114A, D182A, N185A, A152R, or no CBP21 (indicated by a hyphen). Total product release is shown as black bars (24 h), gray bars (48 h), and light gray bars (120 h).View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Hydrolysis of Other Chitin Forms—The three family 18 chitinases from S. marcescens can degrade several chitin forms for which CBP21 has low affinity, for example α-chitin from crab shells and shrimp shells. Experiments similar to the ones described above showed that addition of CBP21 at concentrations up to as high as 5 μm did not affect of the efficiency of ChiA, ChiB, and ChiC toward these substrates (results not shown). The present results show that CBP21 from S. marcescens interferes with the crystalline structure of β-chitin (Fig. 1), which leads to increased enzymatic turnover of the substrate, regardless of which chitinase(s) is/are present (Figs. 2 and 4). The results also show that this effect of CBP21 is not due to formation of specific stoichiometric CBP21-chitinase complexes but rather to a more general effect of CBP21 on substrate availability (Figs. 2 and 3). More than 5 decades ago, it was proposed that degradation of insoluble cellulose was governed by two consecutive phases, an initial non-hydrolytic phase making the substrate accessible for hydrolytic enzymes, followed by the actual hydrolysis phase (42.Reese E.T. Siu R.G.H. Levinson H.S. J. Bacteriol. 1950; 59: 485-497Crossref PubMed Google Scholar). In the period of time following this postulation, two groups have shown that, indeed, the isolated auxiliary CBMs of two cellulases can disrupt the structure of crystalline cellulose (34.Gao P.J. Chen G.J. Wang T.H. Zhang Y.S. Liu J. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2001; 33: 13-18PubMed Google Scholar, 35.Din N. Gilkes N.R. Tekant B. Miller R.C. Warren A.J. Kilburn D.G. Biotechnology. 1991; 9: 1096-1099Crossref Scopus (257) Google Scholar). In 1994 Din et al. (36.Din N. Damude H.G. Gilkes N.R. Miller Jr., R.C. Warren R.A. Kilburn D.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 11383-11387Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar) showed that the auxiliary CBM of CenA, an endoglucanase from Cellulomonas fimi, increases the substrate availability for the catalytic domain, thus increasing the efficiency of CenA. While chitinases such as ChiA, ChiB, and ChiC also contain auxiliary CBMs, most microorganisms containing chitinase genes also contain a gene encoding for a homologue of CBP21, that is, a non-catalytic chitin-binding protein. Although these proteins have been hypothesized to assist chitinases in chitin degradation, possibly by disrupting chitin (25.Schnellmann J. Zeltins A. Blaak H. Schrempf H. Mol. Microbiol. 1994; 13: 807-819Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar), this has so far not been shown experimentally. ChiA, ChiB, and ChiC differ in their efficiency toward β-chitin (Fig. 1) and other chitin forms, 3G. Vaaje-Kolstad, S. J. Horn, and V. G. H. Eijsink, unpublished observations. which may in part be due to the fact that these enzymes have different types of auxiliary CBMs (ChiA contains a fibronectin type III-like CBM, ChiB contains a family 5 CBM, and ChiC contains a family 12 and an fibronectin type III-like CBM; see afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ for family classification). In all cases though, CBP21 had beneficial effects on enzyme efficiency. The most dramatic effects were observed with ChiB and the family 19 chitinase ChiG (a chitinase without auxilliary CBMs), for which the presence of CBP21 was essential to obtain full substrate conversion. The degradation of β-chitin appeared biphasic, indicating the presence of two substrate forms with different degrees of accessibility. Addition of CBP21 hardly affected the fast first phase of degradation, while it had large effects on the slow second phase. It is conceivable that the fast phase represents degradation of easily accessible amorphous regions in the substrate, while the slow, CBP21-sensitive phase is likely to represent degradation of more recalcitrant crystalline regions. CBMs from cellulases or chitinases with known structures all have binding surfaces containing several aromatic residues, often tryptophans. Remarkably the structure of CBP21 showed that the surface of CBP21 is devoid of such an extended aromatic binding surface but contains a surface patch of largely hydrophilic residues that are conserved (Fig. 5; note that this patch does contain the only aromatic residue on the CBP21 surface, Tyr54). It had already been shown that individual mutation of these conserved residues reduces affinity for chitin 3–8-fold (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar). Here, we show that five out of six mutants with reduced affinity for chitin have a strongly reduced ability to promote chitinase activity (Fig. 6). Strikingly, while these mutants only showed a 3–8-fold reduction in binding affinity (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar), their functionality could not be fully restored by increasing the CBP concentration by as much as 100-fold. Thus, the effects of individual mutations on chitin binding are modest compared with the effects on the ability to increase substrate accessibility and turnover. Interestingly, the opposite situation was also observed: the N185A mutant showed a 5-fold reduction in chitin affinity (22.Vaaje-Kolstad G. Houston D.R. Riemen A.H. Eijsink V.G.H. van Aalten D.M.F. J. Biol. Chem. 2005; 280: 11313-11319Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (232) Google Scholar) but was still capable of stimulating chitin turnover (Fig. 6). While Asn185 may seem to be important for binding only, the other five mutated residues are apparently involved in specific disruptive interactions with the chitin substrate. It is tempting to speculate that the hydrophilic residues engage in a series of specific hydrogen bonds with the chitin chains and that this could disrupt interchain hydrogen bonding networks. It is also conceivable that such networks specify the substrate specificity of the CBP (strictly β-chitin in the case of CBP21), since, for example, the surfaces of α-chitin and β-chitin differ in terms of the accessibility and spacing of groups that may engage in hydrogen bonds (in β-chitin the chains are packed more “loosely” than in α-chitin, and β-chitin has a higher water content (43.Saito Y. Kumagai H. Wada M. Kuga S. Biomacromolecules. 2002; 3: 407-410Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar, 44.Saito Y. Okano T. Gaill F. Chanzy H. Putaux J.L. Int. J. Biol. Macromol. 2000; 28: 81-88Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar)). It should be noted that there are homologues of CBP21 (e.g. CHB1 from Streptomyces olivaoceviridis, which is 46% identical in sequence) that bind strictly to α-chitin (25.Schnellmann J. Zeltins A. Blaak H. Schrempf H. Mol. Microbiol. 1994; 13: 807-819Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). The cbp21 gene is located 1.5 kb downstream of the chiB gene in S. marcescens, and the CBP21 protein is produced along with ChiB and the other two chitinases, ChiA and ChiC (21.Suzuki K. Suzuki M. Taiyoji M. Nikaidou N. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998; 62: 128-135Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 45.Watanabe T. Kimura K. Sumiya T. Nikaidou N. Suzuki K. Suzuki M. Taiyoji M. Ferrer S. Regue M. J. Bacteriol. 1997; 179: 7111-7117Crossref PubMed Google Scholar, 46.Suzuki K. Uchiyama T. Suzuki M. Nikaidou N. Regue M. Watanabe T. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001; 65: 338-347Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar). Fig. 4 shows that the efficiency of β-chitin degradation was optimal in the presence of all three enzymes and CBP21. Thus, in addition to three chitinases with apparent different roles and capabilities, CBP21 is essential for efficient β-chitin degradation by S. marcescens. Interestingly, S. marcescens grows fast with β-chitin as the sole carbon source, while growth on α-chitin is slow and never yields dense cultures. 4G. Vaaje-Kolstad, unpublished observations. This is in accordance with the substrate specificity of CBP21. Because chitinases degrade structural components in e.g. fungi, insects, and nematodes, they have numerous (potential) applications. For example, it has been shown that transgenic plants expressing heterologous chitinases show increased resistance toward certain plant pathogenic fungi (47.Broglie K. Chet I. Holliday M. Cressman R. Biddle P. Knowlton S. Mauvais C.J. Broglie R. Science. 1991; 254: 1194-1197Crossref PubMed Scopus (819) Google Scholar, 48.Jach G. Gornhardt B. Mundy J. Logemann J. Pinsdorf E. Leah R. Schell J. Maas C. Plant J. 1995; 8: 97-109Crossref PubMed Scopus (446) Google Scholar, 49.Ding X.F. Gopalakrishnan B. Johnson L.B. White F.F. Wang X.R. Morgan T.D. Kramer K.J. Muthukrishnan S. Transgenic Res. 1998; 7: 77-84Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar). The present results indicate that applications of chitinases, e.g. in plague control, may in some cases be improved by not only using the enzyme(s) but also a protein such as CBP21. The fact that homologues of the cbp21 gene seem to occur in many chitinase-producing microorganisms indicates that the use of CBP21-homologues to improve chitin turnover is a strategy commonly employed in nature. We could not detect homologues of CBP21 in Plasmodium and Leishmania which both depend on chitinases during their life cycles (18.Vinetz J.M. Dave S.K. Specht C.A. Brameld K.A. Xu B. Hayward R. Fidock D.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14061-14066Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 19.Schlein Y. Jacobson R.L. Messer G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 9944-9948Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar). It remains to be seen whether these important parasites contain other proteins with the same function as CBP21-like proteins. Interestingly, the genomes of insect viruses contain chitinase genes as well as genes encoding homologues of CBP21, called GP37 or fusolin (20.Hawtin R.E. Zarkowska T. Arnold K. Thomas C.J. Gooday G.W. King L.A. Kuzio J.A. Possee R.D. Virology. 1997; 238: 243-253Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 33.Li Z.F. Li C.B. Yang K. Wang L.H. Yin C. Gong Y.X. Pang Y. Virus Res. 2003; 96: 113-122Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar, 50.Hawtin R.E. Arnold K. Ayres M.D. Zanotto P.M. Howard S.C. Gooday G.W. Chappell L.H. Kitts P.A. King L.A. Possee R.D. Virology. 1995; 212: 673-685Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 51.Pijlman G.P. Pruijssers A.J. Vlak J.M. J. Gen. Virol. 2003; 84: 2041-2049Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar). It has been shown that the liquefaction of larvae of Autographa californica by a baculovirus depends on the virus-encoded chitinase (20.Hawtin R.E. Zarkowska T. Arnold K. Thomas C.J. Gooday G.W. King L.A. Kuzio J.A. Possee R.D. Virology. 1997; 238: 243-253Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Mitsuhashi and Miyamoto (52.Mitsuhashi W. Miyamoto K. J. Invertebr. Pathol. 2003; 82: 34-40Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar) have suggested that a GP37/fusolin protein is involved in perforation of the peritrophic matrix of silkworm larvae upon viral infection. Additionally, Mitsuhashi et al. (29.Mitsuhashi W. Furuta Y. Sato M. J. Invertebr. Pathol. 1998; 71: 186-188Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar) have shown that fusolin increases the infectiousness of a silkworm baculovirus up to 10,000-fold when fed to silkworm larvae prior to infection. Based on the results presented above, it is tempting to speculate that GP37/fusolin proteins in insect viruses contribute to infectivity by facilitating chitinase action. We thank Ingunn Alne Hoell and Ellinor Heggset for a sample of purified ChiG. We thank Torill M. Rolfsen, Department of Molecular Biosciences at the University of Oslo, for help with electron microscopy.

Abstract Bacterial proteins categorized as family 33 carbohydrate‐binding modules (CBM33) were recently shown to cleave crystalline chitin, using a mechanism that involves hydrolysis and oxidation. We show here that some members of the CBM33 family cleave crystalline cellulose as demonstrated by chromatographic and mass spectrometric analyses of soluble products released from Avicel or filter paper on incubation with CelS2, a CBM33‐containing protein from Streptomyces coelicolor A3(2). These enzymes act synergistically with cellulases and may thus become important tools for efficient conversion of lignocellulosic biomass. Fungal proteins classified as glycoside hydrolase family 61 that are known to act synergistically with cellulases are likely to use a similar mechanism.

Lignocellulosic biomass is a renewable resource that significantly can substitute fossil resources for the production of fuels, chemicals, and materials. Efficient saccharification of this biomass to fermentable sugars will be a key technology in future biorefineries. Traditionally, saccharification was thought to be accomplished by mixtures of hydrolytic enzymes. However, recently it has been shown that lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) contribute to this process by catalyzing oxidative cleavage of insoluble polysaccharides utilizing a mechanism involving molecular oxygen and an electron donor. These enzymes thus represent novel tools for the saccharification of plant biomass. Most characterized LPMOs, including all reported bacterial LPMOs, form aldonic acids, i.e., products oxidized in the C1 position of the terminal sugar. Oxidation at other positions has been observed, and there has been some debate concerning the nature of this position (C4 or C6). In this study, we have characterized an LPMO from Neurospora crassa (NcLPMO9C; also known as NCU02916 and NcGH61–3). Remarkably, and in contrast to all previously characterized LPMOs, which are active only on polysaccharides, NcLPMO9C is able to cleave soluble cello-oligosaccharides as short as a tetramer, a property that allowed detailed product analysis. Using mass spectrometry and NMR, we show that the cello-oligosaccharide products released by this enzyme contain a C4 gemdiol/keto group at the nonreducing end. Lignocellulosic biomass is a renewable resource that significantly can substitute fossil resources for the production of fuels, chemicals, and materials. Efficient saccharification of this biomass to fermentable sugars will be a key technology in future biorefineries. Traditionally, saccharification was thought to be accomplished by mixtures of hydrolytic enzymes. However, recently it has been shown that lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) contribute to this process by catalyzing oxidative cleavage of insoluble polysaccharides utilizing a mechanism involving molecular oxygen and an electron donor. These enzymes thus represent novel tools for the saccharification of plant biomass. Most characterized LPMOs, including all reported bacterial LPMOs, form aldonic acids, i.e., products oxidized in the C1 position of the terminal sugar. Oxidation at other positions has been observed, and there has been some debate concerning the nature of this position (C4 or C6). In this study, we have characterized an LPMO from Neurospora crassa (NcLPMO9C; also known as NCU02916 and NcGH61–3). Remarkably, and in contrast to all previously characterized LPMOs, which are active only on polysaccharides, NcLPMO9C is able to cleave soluble cello-oligosaccharides as short as a tetramer, a property that allowed detailed product analysis. Using mass spectrometry and NMR, we show that the cello-oligosaccharide products released by this enzyme contain a C4 gemdiol/keto group at the nonreducing end.

Many fungi growing on plant biomass produce proteins currently classified as glycoside hydrolase family 61 (GH61), some of which are known to act synergistically with cellulases. In this study we show that PcGH61D, the gene product of an open reading frame in the genome of Phanerochaete chrysosporium, is an enzyme that cleaves cellulose using a metal-dependent oxidative mechanism that leads to generation of aldonic acids. The activity of this enzyme and its beneficial effect on the efficiency of classical cellulases are stimulated by the presence of electron donors. Experiments with reduced cellulose confirmed the oxidative nature of the reaction catalyzed by PcGH61D and indicated that the enzyme may be capable of penetrating into the substrate. Considering the abundance of GH61-encoding genes in fungi and genes encoding their functional bacterial homologues currently classified as carbohydrate binding modules family 33 (CBM33), this enzyme activity is likely to turn out as a major determinant of microbial biomass-degrading efficiency.

The emerging bioeconomy depends on improved methods for processing of lignocellulosic biomass to fuels and chemicals. Saccharification of lignocellulose to fermentable sugars is a key step in this regard where enzymatic catalysis plays an important role and is a major cost driver. Traditionally, enzyme cocktails for the conversion of cellulose to fermentable sugars mainly consisted of hydrolytic cellulases. However, the recent discovery of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), which cleave cellulose using molecular oxygen and an electron donor, has provided new tools for biomass saccharification.Current commercial enzyme cocktails contain LPMOs, which, considering the unique properties of these enzymes, may change optimal processing conditions. Here, we show that such modern cellulase cocktails release up to 60 % more glucose from a pretreated lignocellulosic substrate under aerobic conditions compared to anaerobic conditions. This higher yield correlates with the accumulation of oxidized products, which is a signature of LPMO activity. Spiking traditional cellulase cocktails with LPMOs led to increased saccharification yields, but only under aerobic conditions. LPMO activity on pure cellulose depended on the addition of an external electron donor, whereas this was not required for LPMO activity on lignocellulose.In this study, we demonstrate a direct correlation between saccharification yield and LPMO activity of commercial enzyme cocktails. Importantly, we show that the LPMO contribution to overall efficiency may be large if process conditions are adapted to the key determinants of LPMO activity, namely the presence of electron donors and molecular oxygen. Thus, the advent of LPMOs has a great potential, but requires rethinking of industrial bioprocessing procedures.