Abstract Genetic diversity is key to crop improvement. Owing to pervasive genomic structural variation, a single reference genome assembly cannot capture the full complement of sequence diversity of a crop species (known as the ‘pan-genome’ 1 ). Multiple high-quality sequence assemblies are an indispensable component of a pan-genome infrastructure. Barley ( Hordeum vulgare L.) is an important cereal crop with a long history of cultivation that is adapted to a wide range of agro-climatic conditions 2 . Here we report the construction of chromosome-scale sequence assemblies for the genotypes of 20 varieties of barley—comprising landraces, cultivars and a wild barley—that were selected as representatives of global barley diversity. We catalogued genomic presence/absence variants and explored the use of structural variants for quantitative genetic analysis through whole-genome shotgun sequencing of 300 gene bank accessions. We discovered abundant large inversion polymorphisms and analysed in detail two inversions that are frequently found in current elite barley germplasm; one is probably the product of mutation breeding and the other is tightly linked to a locus that is involved in the expansion of geographical range. This first-generation barley pan-genome makes previously hidden genetic variation accessible to genetic studies and breeding.

Abstract RNA-seq analysis of gene expression and alternative splicing should be routine and robust but is often a bottleneck for biologists because of reliance on specialized bioinformatics skills. Thus, we have developed “ 3D RNA-seq ”, an R shiny App and web based service which provides an easy-to-use, flexible and powerful tool for three-component analysis of RNA-seq data: Differential Expression, Differential Alternative Splicing and Differential Transcript Usage. 3D RNA-seq integrates state-of-the-art, highly rated differential expression analysis tools and adopts best practice for RNA-seq analysis. It operates through a user-friendly graphical interface, can handle complex experimental designs, allows setting of statistical parameters, tracks results through graphics and tables, and generates figures and a comprehensive report that will guarantee reproducibility. 3D RNA-seq can be applied to any species and is designed to be run by biologists with no programming skills (or by bioinformaticians) allowing lab scientists to perform rapid and accurate analysis of RNA-seq data.

ABSTRACT In flowering plants, successful germinal cell development and meiotic recombination depend upon a combination of environmental and genetic factors. To gain insights into this specialised reproductive development programme we used short- and long-read RNA-sequencing (RNA-seq) to study the temporal dynamics of transcript abundance in immuno-cytologically staged barley ( Hordeum vulgare ) anthers and meiocytes. We show that the most significant transcriptional changes occur at the transition from pre-meiosis to leptotene–zygotene, which is followed by largely stable transcript abundance throughout prophase I. Our analysis reveals that the developing anthers and meiocytes are enriched in long non-coding RNAs (lncRNAs) and that entry to meiosis is characterized by their robust and significant down regulation. Intriguingly, only 24% of a collection of putative meiotic gene orthologues showed differential transcript abundance in at least one stage or tissue comparison. Changes in the abundance of numerous transcription factors, representatives of the small RNA processing machinery, and post-translational modification pathways highlight the complexity of the regulatory networks involved. These developmental, time-resolved, and dynamic transcriptomes increase our understanding of anther and meiocyte development and will help guide future research. One sentence summary Analysis of RNA-seq data from meiotically staged barley anthers and meiocytes highlights the role of lncRNAs within a complex network of transcriptional and post-transcriptional regulation accompanied by a hiatus in differential gene expression during prophase I. The author responsible for distribution of materials integral to the findings presented in this article in accordance with the policy described in the Instructions for Authors ( www.plantcell.org ) is: Robbie Waugh ( robbie.waugh@hutton.ac.uk )

Abstract Background Accurate and comprehensive annotation of transcript sequences is essential for transcript quantification and differential gene and transcript expression analysis. Single molecule long read sequencing technologies provide improved integrity of transcript structures including alternative splicing, and transcription start and polyadenylation sites. However, accuracy is significantly affected by sequencing errors, mRNA degradation or incomplete cDNA synthesis. Results We present a new and comprehensive Arabidopsis thaliana Reference Transcript Dataset 3 (AtRTD3). AtRTD3 contains over 160k transcripts - twice that of the best current Arabidopsis transcriptome and including over 1,500 novel genes. 79% of transcripts are from Iso-seq with accurately defined splice junctions and transcription start and end sites. We developed novel methods to determine splice junctions and transcription start and end sites accurately. Mis- match profiles around splice junctions provided a powerful feature to distinguish correct splice junctions and remove false splice junctions. Stratified approaches identified high confidence transcription start/end sites and removed fragmentary transcripts due to degradation. AtRTD3 is a major improvement over existing transcriptomes as demonstrated by analysis of an Arabidopsis cold response RNA-seq time-series. AtRTD3 provided higher resolution of transcript expression profiling and identified cold- and light-induced differential transcription start and polyadenylation site usage. Conclusions AtRTD3 is the most comprehensive Arabidopsis transcriptome currently available. It improves the precision of differential gene and transcript expression, differential alternative splicing, and transcription start/end site usage from RNA-seq data. The novel methods for identifying accurate splice junctions and transcription start/end sites are widely applicable and will improve single molecule sequencing analysis from any species.

ABSTRACT Accurate characterization of splice junctions as well as transcription start and end sites in reference transcriptomes allows precise quantification of transcripts from RNA-seq data and enable detailed investigations of transcriptional and post-transcriptional regulation. Using novel computational methods and a combination of PacBio Iso-seq and Illumina short read sequences from 20 diverse tissues and conditions, we generated a comprehensive and highly resolved barley reference transcript dataset (RTD) from the European 2-row spring barley cultivar Barke (BaRTv2.18). Stringent and thorough filtering was carried out to maintain the quality and accuracy of the splice junctions and transcript start and end sites. BaRTv2.18 shows increased transcript diversity and completeness compared to an earlier version, BaRTv1.0. The accuracy of transcript level quantification, splice junctions and transcript start and end sites has been validated extensively using parallel technologies and analysis, including high resolution RT PCR and 5’ RACE. BaRTv2.18 contains 39,434 genes and 148,260 transcripts, representing the most comprehensive and resolved reference transcriptome in barley to date. It provides an important and high-quality resource for advanced transcriptomic analyses, including both transcriptional and post-transcriptional regulation, with exceptional resolution and precision.

Abstract In cereals with hollow internodes, lodging resistance is influenced by morphological characteristics such as internode diameter and culm wall thickness. Despite their relevance, knowledge of the genetic control of these traits and their relationship with lodging is lacking in temperate cereals such as barley. To fill this gap, we developed an image-analysis based protocol to accurately phenotype culm diameter and culm wall thickness across 261 barley accessions. Analysis of culm trait data collected from field trials in 7 different environments revealed genetic control as supported by high heritability values, as well as genotype-by-environment interactions. The collection was structured mainly according to row-type, which had a confounding effect on culm traits as evidenced by phenotypic correlations. In addition, culm traits showed strong negative correlations with lodging but weak correlations with plant height across row-types, indicating the possibility of improving lodging resistance independent of plant height. Using 50k iSelect SNP genotyping data, we conducted multi-environment genome-wide association studies using mixed model approach across the whole panel and row-type subsets: we identified a total of 192 QTLs for the studied traits, including subpopulation-specific QTLs and several main effect loci for culm traits showing negative effects on lodging without impacting plant height. Providing first insights into the genetic architecture of culm morphology in barley and the possible role of candidate genes involved in hormone and cell wall related pathways, this work supports the potential of loci underpinning culm features to improve lodging resistance and increase barley yield stability under changing environments. One-sentence summary Genetic analysis of a diverse collection of European barleys reveals genomic regions underpinning stem morphological features associated with lodging resistance.

Phenolic acids in cereal grains have important health-promoting properties and influence digestibility for industrial or agricultural uses. Here we identify alleles of a single BAHD p- coumaroyl arabinoxylan transferase gene, HvAT10 , as responsible for the natural variation in cell wall-esterified p -coumaric and ferulic acid in whole grain of a collection of cultivated two-row spring barley genotypes. We show that HvAT10 is rendered non-functional by a premature stop codon mutation in approximately half of the genotypes in our mapping panel. The causal mutation is virtually absent in wild and landrace germplasm suggesting an important function for grain arabinoxylan p -coumaroylation pre-domestication that is dispensable in modern agriculture. Intriguingly, we detected detrimental impacts of the mutated locus on barley grain quality traits. We propose that HvAT10 could be a focus for future grain quality improvement or for manipulating phenolic acid content of wholegrain food products.

Abstract During meiosis, genetic recombination occurs via repair of DNA double-strand breaks (DSBs) as crossovers (COs) resulting in the exchange of parental genetic material (1). Crossovers are important for chromosome segregation and shuffling genetic variation, but their number and distribution are tightly regulated (2). In barley and other large genome cereals, recombination events are limited in number and mainly restricted to the ends of chromosomes (3), constraining progress in plant breeding. Recent studies have highlighted subtle differences in meiotic progression (4, 5) and the distribution of recombination events in barley compared to other plants (6-8), indicating possible evolutionary divergence of the meiotic program in large genome crops. Here we identify a spontaneous loss of function mutation in the grass specific E3 ubiquitin ligase HvST1 ( Sticky Telomeres 1 ) which results in semi-sterility in barley. We show that abnormal synapsis in the absence of HvST1 function increases overall recombination by up to 2.5-fold and that HvST1 is capable of ubiquitinating ASY1, a key component of the lateral elements of the synaptonemal complex. Our findings shed light on a novel—and evolutionarily divergent—pathway regulating synapsis and recombination in cereals. This natural loss of function variant presents new opportunities for the modulation of recombination in large genome cereals. Significance Statement Climate change places significant strain on crop production. Crop secondary gene pools offer an excellent resource for crop improvement. However, linkage drag driven by restrictions to meiotic recombination can impose severe yield or quality penalties from introgression of traits from secondary gene pools to elite varieties. Here, we characterize a spontaneous mutation in the barley E3 ubiquitin HvST1 that leads to a significant increase in recombination. Through biochemical analysis of the wild type protein we identified a putative role for this ligase in regulating synapsis. This furthers our understanding of the control of synapsis in large genome cereals and may be of direct use in traditional barley breeding.

Using a positional candidate-gene approach we show that semi-sterile desynaptic8 mutants are associated with deletions in or of the barley homolog of XRCC2 (X-Ray Repair Cross Complementing 2). In barley XRCC2 mutants, the initial meiotic progression is normal, albeit with a small delay in initiation, with completion of synapsis. Subsequently, however, the absence of HvXRCC2 leads to a dramatic reduction in the number of crossovers, chromosome mis-segregation and infertility, suggesting that HvXRCC2 plays a major role in recombination. This mutant phenotype is congruent with that reported in mammalian studies but contrasts with the XRCC2 mutant in Arabidopsis which is fertile, exhibits normal chromosome pairing and correct chromosome segregation and is associated with an increased rate of crossovers. This study in barley indicates that the XRCC2 mutant phenotype in Arabidopsis is thus not representative of all plants and that XRCC2 is not a good candidate for the modulation of recombination in barley.

Abstract A prerequisite to exploiting soil microbes for sustainable crop production is the identification of the plant genes shaping microbiota composition in the rhizosphere, the interface between roots and soil. Here we use metagenomics information as an external quantitative phenotype to map the host genetic determinants of the rhizosphere microbiota in wild and domesticated genotypes of barley, the fourth most cultivated cereal globally. We identify a small number of loci with a major effect on the composition of rhizosphere communities. One of those, designated the QRMC-3HS , emerges as a major determinant of microbiota composition. We subject soil-grown sibling lines harbouring contrasting alleles at QRMC-3HS and hosting contrasting microbiotas to comparative root RNA-seq profiling. This allows us to identify three primary candidate genes, including a Nucleotide-Binding-Leucine-Rich-Repeat ( NLR ) gene in a region of structural variation of the barley genome. Our results provide insights into the footprint of crop improvement on the plant’s capacity of shaping rhizosphere microbes.