Synaptic vesicle fusion, as evoked by action potentials, is confined to presynaptic protein nanoclusters, which are closely aligned with concentrated postsynaptic receptors and their scaffolding proteins—an organization termed a ‘nanocolumn’. Efficient neurotransmission has long been suspected to require precise alignment between pre-synaptic vesicle release sites and post-synaptic receptors, but direct observations have been hampered by the physics of light-microscopy. Thomas Blanpied and colleagues use hyper-resolution microscopy — which overcomes the diffraction barrier — to reveal that vesicular fusion at single synapses, as evoked by action potentials, is confined to pre-synaptic protein nanoclusters. The nanoclusters are closely aligned with concentrated post-synaptic receptors and their scaffolding proteins. The resulting molecular 'nanocolumns' are reorganized during NMDA receptor-dependent plasticity, and the authors suggest that they may contribute to the maintenance and regulation of synaptic efficiency. Synaptic transmission is maintained by a delicate, sub-synaptic molecular architecture, and even mild alterations in synapse structure drive functional changes during experience-dependent plasticity and pathological disorders1,2. Key to this architecture is how the distribution of presynaptic vesicle fusion sites corresponds to the position of receptors in the postsynaptic density. However, while it has long been recognized that this spatial relationship modulates synaptic strength3, it has not been precisely described, owing in part to the limited resolution of light microscopy. Using localization microscopy, here we show that key proteins mediating vesicle priming and fusion are mutually co-enriched within nanometre-scale subregions of the presynaptic active zone. Through development of a new method to map vesicle fusion positions within single synapses in cultured rat hippocampal neurons, we find that action-potential-evoked fusion is guided by this protein gradient and occurs preferentially in confined areas with higher local density of Rab3-interacting molecule (RIM) within the active zones. These presynaptic RIM nanoclusters closely align with concentrated postsynaptic receptors and scaffolding proteins4,5,6, suggesting the existence of a trans-synaptic molecular ‘nanocolumn’. Thus, we propose that the nanoarchitecture of the active zone directs action-potential-evoked vesicle fusion to occur preferentially at sites directly opposing postsynaptic receptor–scaffold ensembles. Remarkably, NMDA receptor activation triggered distinct phases of plasticity in which postsynaptic reorganization was followed by trans-synaptic nanoscale realignment. This architecture suggests a simple organizational principle of central nervous system synapses to maintain and modulate synaptic efficiency.

Abstract Cells and tissues are made out of nanoscale building blocks, such as proteins, organized in crowded nanostructures. We show that many biomolecules, and the nanostructures in which they are embedded, may be invisible to prior imaging techniques, due to the inaccessibility of labels (e.g., antibodies) to biomolecules embedded within such crowded structures. We developed a technology, expansion revealing (ExR), which isotropically decrowds proteins from each other, to enable their labeling. We use ExR to discover the alignment of presynaptic calcium channels with postsynaptic machinery in intact brain circuits, as well as the existence of periodic amyloid nanoclusters containing ion channel proteins in Alzheimer’s model mice. Thus, ExR reveals nanostructures within complex biological specimens that were not previously visualizable, and may find broad use in biology. One Sentence Summary De-crowding biomolecules with Expansion Revealing unmasks fundamentally new nanostructures in intact brain tissue, which remained invisible otherwise.

Abstract Endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) sits at the heart of the calcium (Ca 2+ ) signaling machinery, yet current genetically encoded Ca 2+ indicators (GECIs) lack the ability to detect elementary Ca 2+ release events from ER/SR, particularly in muscle cells. Here we report a set of organellar GECIs, termed NEMOer, to efficiently capture ER Ca 2+ dynamics with increased sensitivity and responsiveness. Compared to G-CEPIA1er, NEMOer indicators exhibit dynamic ranges that are an order of magnitude larger, which enables up to 5-fold more sensitive detection of Ca 2+ oscillation in both non-excitable and excitable cells. The ratiometric version further allows super-resolution monitoring of local ER Ca 2+ homeostasis and dynamics. Notably, the NEMOer-f variant enabled the inaugural detection of Ca 2+ blinks, elementary Ca 2+ releasing signals from the SR of cardiomyocytes, as well as in vivo spontaneous SR Ca 2+ releases in zebrafish. In summary, the highly dynamic NEMOer sensors expand the repertoire of organellar Ca 2+ sensors that allow real-time monitoring of intricate Ca 2+ dynamics and homeostasis in live cells with high spatiotemporal resolution.

Abstract Recent evidence suggests that nanoorganization of proteins within synapses may control the strength of communication between neurons in the brain. The unique subsynaptic distribution of glutamate receptors, which cluster in nanoalignment with presynaptic sites of glutamate release, supports this idea. However, testing it has been difficult because mechanisms controlling subsynaptic organization remain unknown. Reasoning that transcellular interactions could position AMPA receptors, we targeted a key transsynaptic adhesion molecule implicated in controlling AMPAR number, LRRTM2, using engineered, rapid proteolysis. Severing the LRRTM2 extracellular domain led quickly to nanoscale de-clustering of AMPARs away from release sites, not prompting their escape from synapses until much later. This rapid remodeling of AMPAR position produced significant deficits in evoked, but not spontaneous, postsynaptic receptor activation. These results dissociate receptor numbers from their nanopositioning in determination of synaptic function, and support the novel concept that adhesion molecules acutely position AMPA receptors to dynamically control synaptic strength.

Exogenous cannabinoids can affect behaviorally relevant neuronal oscillations, but there is little evidence that endogenous cannabinoids (endocannabinoids, eCBs) can affect them, although it is unknown whether eCBs were generated during oscillations investigated in previous studies. In rat hippocampal slices, muscarinic receptor (mAChR) agonists stimulate the occurrence of persistent, rhythmic inhibitory post-synaptic currents (IPSC) activity and mobilize eCBs. We tested the hypothesis that mAChR-induced IPSCs would be modulated by concomitantly produced eCBs. With ionotropic glutamate receptors inhibited, mAChR agonist application triggered eCB-sensitive IPSCs that were enhanced in amplitude and frequency when a cannabinoid receptor antagonist was also present. There was also a highly significant increase in IPSC spectral power in the theta-frequency range. The data show that eCBs released by mAChRs modulate rhythmic IPSCs, and suggest that eCBs are candidate regulators of neuronal oscillations associated with eCB production in vivo.

Nanoscale distribution of proteins and their relative positioning within a defined subcellular region are key to their physiological functions. Thanks to the super-resolution imaging methods, especially the single-molecule localization microscopy (SMLM), mapping the three-dimensional distribution of multiple proteins has been easier and more efficient than ever. In spite of the many tools available for efficient localization detection and image rendering, it has been a challenge to quantitatively analyze the 3D distribution and relative positioning of proteins in these SMLM data. Here, using the heterogeneously distributed synaptic proteins as examples, we describe in detail a series of analytical methods including detection of nanoscale density clusters, quantification of the trans-synaptic alignment between these protein densities, and automatic enface projection and averaging. These analyses were performed within customized Matlab routines and we make the full scripts available. The concepts behind these analytical methods and the scripts can be adapted for quantitative analysis of spatial organization of other macromolecular complexes.

Abstract Genetically-encoded calcium indicators (GECI) are indispensable tools for real-time monitoring of intracellular calcium signals and cellular activities in living organisms. Current GECIs face the challenge of sub-optimal peak signal-to-baseline-ratio (SBR) with limited resolution for reporting subtle calcium transients. We report herein the development of a suite of calcium sensors, designated NEMO, with fast kinetics and wide dynamic ranges (>100-fold). NEMO indicators report Ca 2+ transients with peak SBRs ~20-fold larger than the top-of-the-range GCaMP series. NEMO sensors further enable the quantification of absolution calcium concentration with ratiometric or photochromic imaging. Compared to GCaMPs, NEMOs could detect single action potentials in neurons with a peak SBR two times higher and a median peak SBR four times larger in vivo , thereby outperforming most existing state-of-the-art GECIs. Given their high sensitivity and resolution to report intracellular Ca 2+ signals, NEMO sensors may find broad applications in monitoring neuronal activities and other Ca 2+ -modulated physiological processes in both mammals and plants.