Diverse regions develop within cerebral organoids generated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs), however it has been a challenge to understand the lineage dynamics associated with brain regionalization. Here we establish an inducible lineage recording system that couples reporter barcodes, inducible CRISPR/Cas9 scarring, and single-cell transcriptomics to analyze lineage relationships during cerebral organoid development. We infer fate-mapped whole organoid phylogenies over a scarring time course, and reconstruct progenitor-neuron lineage trees within microdissected cerebral organoid regions. We observe increased fate restriction over time, and find that iPSC clones used to initiate organoids tend to accumulate in distinct brain regions. We use lineage-coupled spatial transcriptomics to resolve lineage locations as well as confirm clonal enrichment in distinctly patterned brain regions. Using long term 4-D light sheet microscopy to temporally track nuclei in developing cerebral organoids, we link brain region clone enrichment to positions in the neuroectoderm, followed by local proliferation with limited migration during neuroepithelial formation. Our data sheds light on how lineages are established during brain organoid regionalization, and our techniques can be adapted in any iPSC-derived cell culture system to dissect lineage alterations during perturbation or in patient-specific models of disease.

Human intestinal organoids (HIOs) generated from pluripotent stem cells provide extraordinary opportunities to explore development and disease. Here, we generate a single-cell transcriptome reference atlas from HIOs and from multiple developing human organs to quantify the specificity of HIO cell fate acquisition, and to explore alternative fates. We identify epithelium-mesenchyme interactions, transcriptional regulators involved in cell fate specification, and stem cell maturation features in the primary tissue that are recapitulated in HIOs. We use an HIO time course to reconstruct the molecular dynamics of intestinal stem cell emergence, as well as the specification of multiple mesenchyme subtypes. We find that the intestinal master regulator CDX2 correlates with distinct phases of epithelial and mesenchymal development, and CDX2 deletion perturbs the differentiation of both intestinal epithelium and mesenchyme. Collectively our data provides a comprehensive and quantitative assessment of HIO development, and illuminates the molecular machinery underlying endodermal and mesodermal cell fate specification.

Abstract The liver has the remarkable capacity to regenerate. In the clinic, regeneration is induced by portal vein embolization, which redirects portal blood flow, resulting in liver hypertrophy in locations with increased blood supply, and atrophy of embolized segments. Here, we apply single-cell and single-nucleus transcriptomics on healthy, hypertrophied, and atrophied patient-derived liver samples to explore cell states in the regenerating liver. Our data unveils pervasive upregulation of genes associated with developmental processes, cellular adhesion, and inflammation in post-portal vein embolization liver, disrupted portal-central hepatocyte zonation, and altered cell subtype composition of endothelial and immune cells. Interlineage crosstalk analysis reveals mesenchymal cells as an interaction hub between immune and endothelial cells, and highlights the importance of extracellular matrix proteins in liver regeneration. Moreover, we establish tissue-scale iterative indirect immunofluorescence imaging for high-dimensional spatial analysis of perivascular microenvironments, uncovering changes to tissue architecture in regenerating liver lobules. Altogether, our data is a rich resource revealing cellular and histological changes in human liver regeneration.

Summary Epithelial organoids derived from intestinal tissue, also referred to as mini-intestines or mini-guts, recapitulate many aspects of the organ in vitro and can be used for biological discovery, personalized medicine, and drug development. Murine intestinal organoids represent a homeostatic system that balances stem cell maintenance within a crypt-like compartment and differentiation within a villus-like compartment 1–3 . However, this homeostatic balance and spatial organization has not been achieved with human intestinal organoids 4 . Here, we leverage single cell RNA-seq data (scRNA-seq) and high-resolution imaging to interrogate the developing human intestinal stem cell niche. We identified an EGF-family member, EPIREGULIN (EREG), as uniquely expressed in the developing crypt, and found that EREG can take the place of EGF as an in vitro niche factor. Unlike EGF, which leads to growth of thin-walled cystic organoids, EREG-organoids are spatially resolved into budded and proliferative crypt domains and a differentiated villus-like central lumen. Transcriptomics and epigenomics showed that EREG-organoids are globally similar to the native intestine while EGF-organoids have an altered chromatin landscape, downregulate the master intestinal transcription factor CDX2 5,6 , and ectopically express stomach genes.

In multicellular organisms, the specification, coordination, and compartmentalization of cell types enable the formation of complex body plans. However, some eukaryotic protists such as slime molds generate diverse and complex structures while remaining in a multinucleated syncytial state. It is unknown if different regions of these giant syncytial cells have distinct transcriptional responses to environmental encounters, and if nuclei within the cell diversify into heterogeneous states. Here we performed spatial transcriptome analysis of the slime mold Physarum polycephalum in the plasmodium state under different environmental conditions, and used single-nucleus RNA-sequencing to dissect gene expression heterogeneity among nuclei. Our data identifies transcriptome regionality in the organism that associates with proliferation, syncytial substructures, and localized environmental conditions. Further, we find that nuclei are heterogenous in their transcriptional profile, and may process local signals within the plasmodium to coordinate cell growth, metabolism, and reproduction. To understand how nuclei variation within the syncytium compares to heterogeneity in single-nucleated cells, we analyzed states in single Physarum amoebal cells. We observed amoebal cell states at different stages of mitosis and meiosis, and identified cytokinetic features that are specific to nuclei divisions within the syncytium. Notably, we do not find evidence for predefined transcriptomic states in the amoebae that are observed in the syncytium. Our data shows that a single-celled slime mold can control its gene expression in a region-specific manner while lacking cellular compartmentalization, and suggests that nuclei are mobile processors facilitating local specialized functions. More broadly, slime molds offer the extraordinary opportunity to explore how organisms can evolve regulatory mechanisms to divide labor, specialize, balance competition with cooperation, and perform other foundational principles that govern the logic of life.

Organoids and organs-on-a-chip have emerged as powerful tools for modeling human gut physiology and disease in vitro. Although physiologically relevant, these systems often lack the environmental milieu, spatial organization, cell type diversity, and maturity necessary for mimicking human intestinal mucosa. To instead generate models closely resembling in vivo tissue, we herein integrated organoid and organ-on-a-chip technology to develop an advanced human organoid model, called "mini-colons." By employing an asymmetric stimulation with growth factors, we greatly enhanced tissue longevity and replicated in vivo-like diversity and patterning of proliferative and differentiated cell types. Mini-colons contain abundant mucus-producing goblet cells and, signifying mini-colon maturation, single-cell RNA sequencing reveals emerging mature and functional colonocytes. This methodology is expanded to generate microtissues from the small intestine and incorporate additional microenvironmental components. Finally, our bioengineered organoids provide a precise platform to systematically study human gut physiology and pathology, and a reliable preclinical model for drug safety assessment.

Abstract Cell fate progression of pluripotent progenitors is strictly regulated, resulting in high human cell diversity. Epigenetic modifications also orchestrate cell fate restriction. Unveiling the epigenetic mechanisms underlying human cell diversity has been difficult. In this study, we use human brain and retina organoid models and present single-cell profiling of H3K27ac, H3K27me3 and H3K4me3 histone modifications from progenitor to differentiated neural fates to reconstruct the epigenomic trajectories regulating cell identity acquisition. We capture transitions from pluripotency through neuroepithelium to retinal and brain region and cell type specification. Switching of repressive and activating epigenetic modifications can precede and predict cell fate decisions at each stage, providing a temporal census of gene regulatory elements and transcription factors. Removing H3K27me3 at the neuroectoderm stage disrupts fate restriction, resulting in aberrant cell identity acquisition. Our single-cell epigenome-wide map of human neural organoid development serves as a blueprint to explore human cell fate determination.

Abstract Liquid-liquid phase separation or condensation is a form of macromolecular compartmentalization. Condensates formed by complex coacervation were hypothesized to have played a crucial part during the origin-of-life. In living cells, condensation organizes biomolecules into a wide range of membraneless compartments. Although RNA is a key component of condensation in cells and the central component of the RNA world hypothesis, little is known about what determines RNA accumulation in condensates and how single condensates differ in their RNA composition. Therefore, we developed an approach to read the RNA content from single condensates using high-throughput sequencing. We find that RNAs which are enriched for specific sequence motifs efficiently accumulate in condensates. These motifs show high sequence similarity to short interspersed elements (SINEs). We observed similar results for protein-derived condensates, demonstrating applicability across different in vitro reconstituted membraneless organelles. Thus, our results provide a new inroad to explore the RNA content of phase-separated droplets at single condensate resolution.

The human brain has changed dramatically since humans diverged from our closest living relatives, chimpanzees and the other great apes. However, the genetic and developmental programs underlying this divergence are not fully understood. Here, we have analyzed stem cell-derived cerebral organoids using single-cell transcriptomics (scRNA-seq) and accessible chromatin profiling (scATAC-seq) to explore gene regulatory changes that are specific to humans. We first analyze cell composition and reconstruct differentiation trajectories over the entire course of human cerebral organoid development from pluripotency, through neuroectoderm and neuroepithelial stages, followed by divergence into neuronal fates within the dorsal and ventral forebrain, midbrain and hindbrain regions. We find that brain region composition varies in organoids from different iPSC lines, yet regional gene expression patterns are largely reproducible across individuals. We then analyze chimpanzee and macaque cerebral organoids and find that human neuronal development proceeds at a delayed pace relative to the other two primates. Through pseudotemporal alignment of differentiation paths, we identify human-specific gene expression resolved to distinct cell states along progenitor to neuron lineages in the cortex. We find that chromatin accessibility is dynamic during cortex development, and identify instances of accessibility divergence between human and chimpanzee that correlate with human-specific gene expression and genetic change. Finally, we map human-specific expression in adult prefrontal cortex using single-nucleus RNA-seq and find developmental differences that persist into adulthood, as well as cell state-specific changes that occur exclusively in the adult brain. Our data provide a temporal cell atlas of great ape forebrain development, and illuminate dynamic gene regulatory features that are unique to humans.

Pluripotent stem cells from diverse humans offer the potential to study human functional variation in controlled culture environments. A portion of this variation originates from ancient admixture between modern humans and Neandertals, which introduced alleles that left a phenotypic legacy on individual humans today. Here we show that a large repository of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) harbors extensive Neandertal DNA, including most known functionally relevant Neandertal alleles present in modern humans. This resource contains Neandertal DNA that contributes to human phenotypes and diseases, encodes hundreds of amino acid changes, and alters gene expression in specific tissues. Human iPSCs thus provide an opportunity to experimentally explore the Neandertal contribution to present-day phenotypes, and potentially study Neandertal traits.