RelTime estimates divergence times by relaxing the assumption of a strict molecular clock in a phylogeny. It shows excellent performance in estimating divergence times for both simulated and empirical molecular sequence data sets in which evolutionary rates varied extensively throughout the tree. RelTime is computationally efficient and scales well with increasing size of data sets. Until now, however, RelTime has not had a formal mathematical foundation. Here, we show that the basis of the RelTime approach is a relative rate framework (RRF) that combines comparisons of evolutionary rates in sister lineages with the principle of minimum rate change between evolutionary lineages and their respective descendants. We present analytical solutions for estimating relative lineage rates and divergence times under RRF. We also discuss the relationship of RRF with other approaches, including the Bayesian framework. We conclude that RelTime will be useful for phylogenies with branch lengths derived not only from molecular data, but also morphological and biochemical traits.

Concurrent molecular dating of population and species divergences is essential in many biological investigations, including phylogeography, phylodynamics, and species delimitation studies. Multiple sequence alignments used in these investigations frequently consist of both intra- and inter-species samples (mixed samples). As a result, the phylogenetic trees contain inter-species, inter-population, and within population divergences. To date these sequence divergences, Bayesian relaxed clock methods are often employed, but they assume the same tree prior for both inter- and intra-species branching processes and require specification of a clock model for branch rates (independent vs. autocorrelated rates models). We evaluated the impact of using the same tree prior on the Bayesian divergence time estimates by analyzing computer-simulated datasets. We also examined the effect of the assumption of independence of evolutionary rate variation among branches when the branch rates are autocorrelated. Bayesian approach with Skyline-coalescent tree priors generally produced excellent molecular dates, with some tree priors (e.g., Yule) performing the best when evolutionary rates were autocorrelated, and lineage sorting was incomplete. We compared the performance of the Bayesian approach with a non-Bayesian, the RelTime method, which does not require specification of a tree prior or selection of a clock model. We found that RelTime performed as well as the Bayesian approach, and when the clock model was mis-specified, RelTime performed slightly better. These results suggest that the computationally efficient RelTime approach is also suitable to analyze datasets containing both populations and species variation.

The RelTime method estimates divergence times when evolutionary rates vary among lineages. Theoretical analyses show that RelTime relaxes the strict molecular clock throughout a molecular phylogeny, and it performs well in the analysis of empirical and computer simulated datasets in which evolutionary rates are variable. Lozano-Fernandez et al. (2017) found that the application of RelTime to one metazoan dataset (Erwin et al. 2011) produced equal rates for several ancient lineages, which led them to speculate that RelTime imposes a strict molecular clock for deep animal divergences. RelTime does not impose a strict molecular clock. The pattern observed by Lozano-Fernandez et al. (2017) was a result of the use of an option to assign the same rate to lineages in RelTime when the rates are not statistically significantly different. The median rate difference was 5% for many deep metazoan lineages for Erwin et al. (2011) dataset, so the rate equality was not rejected. In fact, RelTime analysis with and without the option to test rate differences produced very similar time estimates. We found that the Bayesian time estimates vary widely depending on the root priors assigned, and that the use of less restrictive priors produce Bayesian divergence times that are concordant with those from RelTime for Erwin et al. (2011) dataset. Therefore, it is prudent to discuss Bayesian estimates obtained under a range of priors in any discourse about molecular dating, including method comparisons.

Abstract Motivation Precise time calibrations needed to estimate ages of species divergence are not always available due to fossil records’ incompleteness. Consequently, clock calibrations available for Bayesian dating analyses can be few and diffused, i.e., phylogenies are calibration-poor, impeding reliable inference of the timetree of life. We examined the role of speciation birth-death tree prior on Bayesian node age estimates in calibration-poor phylogenies and tested the usefulness of an informative, data-driven tree prior to enhancing the accuracy and precision of estimated times. Results We present a simple method to estimate parameters of the birth-death tree prior from the molecular phylogeny for use in Bayesian dating analyses. The use of a data-driven birth-death (ddBD) tree prior leads to improvement in Bayesian node age estimates for calibration-poor phylogenies. We show that the ddBD tree prior, along with only a few well-constrained calibrations, can produce excellent node ages and credibility intervals, whereas the use of an uninformative, uniform (flat) tree prior may require more calibrations. Relaxed clock dating with ddBD tree prior also produced better results than a flat tree prior when using diffused node calibrations. We also suggest using ddBD tree priors to improve the detection of outliers and influential calibrations in cross-validation analyses. Conclusion Empirical Bayesian dating analyses with ddBD tree priors enable more accurate and precise node age estimates for calibration-poor phylogenies. Our results have practical applications because the ddBD tree prior reduces the number of well-constrained calibrations necessary to obtain reliable node age estimates. This would help address key impediments in building the grand timetree of life, revealing the process of speciation, and elucidating the dynamics of biological diversification. Availability An R module for computing the ddBD tree prior, simulated datasets, and empirical datasets are available at https://github.com/cathyqqtao/ddBD-tree-prior .

Building reliable phylogenies from very large collections of sequences with a limited number of phylogenetically informative sites is challenging because sequencing errors and recurrent/backward mutations interfere with the phylogenetic signal, confounding true evolutionary relationships. Massive global efforts of sequencing genomes and reconstructing the phylogeny of SARS-CoV-2 strains exemplify these difficulties since there are only hundreds of phylogenetically informative sites and millions of genomes. For such datasets, we set out to develop a method for building the phylogenetic tree of genomic haplotypes consisting of positions harboring common variants to improve the signal-to-noise ratio for more accurate phylogenetic inference of resolvable phylogenetic features.We present the TopHap approach that determines spatiotemporally common haplotypes of common variants and builds their phylogeny at a fraction of the computational time of traditional methods. To assess topological robustness, we develop a bootstrap resampling strategy that resamples genomes spatiotemporally. The application of TopHap to build a phylogeny of 68,057 genomes (68KG) produced an evolutionary tree of major SARS-CoV-2 haplotypes. This phylogeny is concordant with the mutation tree inferred using the co-occurrence pattern of mutations and recovers key phylogenetic relationships from more traditional analyses. We also evaluated alternative roots of the SARS-CoV-2 phylogeny and found that the earliest sampled genomes in 2019 likely evolved by four mutations of the most recent common ancestor of all SARS-CoV-2 genomes. An application of TopHap to more than 1 million genomes reconstructed the most comprehensive evolutionary relationships of major variants, which confirmed the 68KG phylogeny and provided evolutionary origins of major variants of concern.TopHap is available on the web at https://github.com/SayakaMiura/TopHap .s.kumar@temple.edu.

Confidence intervals (CIs) depict the statistical uncertainty surrounding evolutionary divergence time estimates. They capture variance contributed by the finite number of sequences and sites used in the alignment, deviations of evolutionary rates from a strict molecular clock in a phylogeny, and uncertainty associated with clock calibrations. Reliable tests of biological hypotheses demand reliable CIs. However, current non-Bayesian methods may produce unreliable CIs because they do not incorporate rate variation among lineages and interactions among clock calibrations properly. Here, we present a new analytical method to calculate CIs of divergence times estimated using the RelTime method, along with an approach to utilize multiple calibration uncertainty densities in these analyses. Empirical data analyses showed that the new methods produce CIs that overlap with Bayesian highest posterior density (HPD) intervals. In the analysis of computer-simulated data, we found that RelTime CIs show excellent average coverage probabilities, i.e., the true time is contained within the CIs with a 95% probability. These developments will encourage broader use of computationally-efficient RelTime approach in molecular dating analyses and biological hypothesis testing.

The conventional wisdom in molecular evolution is to apply parameter-rich models of nucleotide and amino acid substitutions for estimating divergence times. However, the actual extent of the difference between time estimates produced by highly complex models compared to those from simple models is yet to be quantified for contemporary datasets that frequently contain sequences from many species and genes. In a reanalysis of many large multispecies alignments from diverse groups of taxa using the same tree topologies and calibrations, we found that the use of the simplest models can produce divergence time estimates and credibility intervals similar to those obtained from the complex models applied in the original studies. This result is surprising because the use of simple models underestimates sequence divergence for all the datasets analyzed. We find three fundamental reasons for the observed robustness of time estimates to model complexity in many practical datasets. First, the estimates of branch lengths and node-to-tip distances under the simplest model show an approximately linear relationship with those produced by using the most complex models applied, especially for datasets with many sequences. Second, relaxed clock methods automatically adjust rates on branches that experience considerable underestimation of sequence divergences, resulting in time estimates that are similar to those from complex models. And, third, the inclusion of even a few good calibrations in an analysis can reduce the difference in time estimates from simple and complex models. The robustness of time estimates to models complexity in these empirical data analyses is encouraging, because all phylogenomics studies use statistical models that are oversimplified descriptions of actual evolutionary substitution processes.

Abstract Motivation As the number and diversity of species and genes grow in contemporary datasets, two common assumptions made in all molecular dating methods, namely the time-reversibility and stationarity of the substitution process, become untenable. No software tools for molecular dating allow researchers to relax these two assumptions in their data analyses. Frequently the same General Time Reversible (GTR) model across lineages along with a gamma (+Γ) distributed rates across sites is used in relaxed clock analyses, which assumes time-reversibility and stationarity of the substitution process. Many reports have quantified the impact of violations of these underlying assumptions on molecular phylogeny, but none have systematically analyzed their impact on divergence time estimates. Results We quantified the bias on time estimates that resulted from using the GTR+Γ model for the analysis of computer-simulated nucleotide sequence alignments that were evolved with non-stationary (NS) and non-reversible (NR) substitution models. We tested Bayesian and RelTime approaches that do not require a molecular clock for estimating divergence times. Divergence times obtained using a GTR+Γ model differed only slightly (∼3% on average) from the expected times for NR datasets, but the difference was larger for NS datasets (∼10% on average). The use of only a few calibrations reduced these biases considerably (∼5%). Confidence and credibility intervals from GTR+Γ analysis usually contained correct times. Therefore, the bias introduced by the use of the GTR+Γ model to analyze datasets, in which the time-reversibility and stationarity assumptions are violated, is likely not large and can be reduced by applying multiple calibrations. Availability All datasets are deposited in Figshare: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12594638 . Contact s.kumar@temple.edu

RelTime estimates divergence times by relaxing the assumption of a strict molecular clock in a phylogeny. It showed excellent performance in estimating divergence times for both simulated and empirical molecular sequence datasets in which evolutionary rates varied extensively throughout the tree. RelTime is computationally efficient and scales well with increasing size of datasets. Until now, however, RelTime has not had a formal mathematical foundation. Here, we show that the basis of the RelTime approach is a relative rate framework (RRF) that combines comparisons of evolutionary rates in sister lineages with the principle of minimum rate change between an evolutionary lineage and its descendants. We present analytical solutions for estimating relative lineage rates and divergence times under RRF. We also discuss the relationship of RRF with other approaches, including the Bayesian framework. We conclude that RelTime will be also useful for phylogenies with branch lengths derived not only from molecular data, but also morphological and biochemical traits.