Intestinal organoids are complex three-dimensional structures that mimic the cell-type composition and tissue organization of the intestine by recapitulating the self-organizing ability of cell populations derived from a single intestinal stem cell. Crucial in this process is a first symmetry-breaking event, in which only a fraction of identical cells in a symmetrical sphere differentiate into Paneth cells, which generate the stem-cell niche and lead to asymmetric structures such as the crypts and villi. Here we combine single-cell quantitative genomic and imaging approaches to characterize the development of intestinal organoids from single cells. We show that their development follows a regeneration process that is driven by transient activation of the transcriptional regulator YAP1. Cell-to-cell variability in YAP1, emerging in symmetrical spheres, initiates Notch and DLL1 activation, and drives the symmetry-breaking event and formation of the first Paneth cell. Our findings reveal how single cells exposed to a uniform growth-promoting environment have the intrinsic ability to generate emergent, self-organized behaviour that results in the formation of complex multicellular asymmetric structures.

SummaryCentrosome duplication involves the formation of a single procentriole next to each centriole, once per cell cycle. The mechanisms governing procentriole formation and those restricting its occurrence to one event per centriole are poorly understood. Here, we show that HsSAS-6 is necessary for procentriole formation and that it localizes asymmetrically next to the centriole at the onset of procentriole formation. HsSAS-6 levels oscillate during the cell cycle, with the protein being degraded in mitosis and starting to accumulate again at the end of the following G1. Our findings indicate that APCCdh1 targets HsSAS-6 for degradation by the 26S proteasome. Importantly, we demonstrate that increased HsSAS-6 levels promote formation of more than one procentriole per centriole. Therefore, regulated HsSAS-6 levels normally ensure that each centriole seeds the formation of a single procentriole per cell cycle, thus playing a fundamental role in driving the centrosome duplication cycle and ensuring genome integrity.

Abstract Rhythmic and sequential segmentation of the growing vertebrate body relies on the segmentation clock, a multi-cellular oscillating genetic network. The clock is visible as tissue-level kinematic waves of gene expression that travel through the pre-somitic mesoderm (PSM) and arrest at the position of each forming segment. Here we test how this hallmark wave pattern is driven by culturing single maturing PSM cells. We compare their cell-autonomous oscillatory and arrest dynamics to those we observe in the embryo at cellular resolution, finding remarkable agreement. This suggests that cell-extrinsic signals are not used by the cells to instruct the developmental program underlying the wave pattern. In contrast, we show that a cell-autonomous timing activity initiates during cell exit from the tailbud, then runs down in the anterior-ward cell flow in the PSM, thereby using elapsed time to provide positional information to the clock. Exogenous FGF lengthens the duration of the cell-intrinsic timer, indicating extrinsic factors in the embryo may regulate the segmentation clock via the timer. In sum, our work suggests that a noisy cell-autonomous, intrinsic timer drives the slowing and arrest of oscillations underlying the wave pattern, while extrinsic factors in the embryo tune this timer’s duration and precision. This is a new insight into the balance of cell-intrinsic and -extrinsic mechanisms driving tissue patterning in development.

Abstract Organoids provide an accessible in-vitro system to mimic the dynamics of tissue regeneration and development. However, long-term live-imaging of organoids remains challenging. Here we present an experimental and image-processing framework capable of turning long-term light-sheet imaging of intestinal organoids into digital organoids. The framework combines specific imaging optimization combined with data processing via deep learning techniques to segment single organoids, their lumen, cells and nuclei in 3D over long periods of time. By linking lineage trees with corresponding 3D segmentation meshes for each organoid, the extracted information is visualized using a web-based “Digital Organoid Viewer” tool allowing unique understanding of the multivariate and multiscale data. We also show backtracking of cells of interest, providing detailed information about their history within entire organoid contexts. Furthermore, we show cytokinesis failure of regenerative cells and that these cells never reside in the intestinal crypt, hinting at a tissue scale control on cellular fidelity.

Rhythmic and sequential segmentation of the growing vertebrate body relies on the segmentation clock, a multi-cellular oscillating genetic network. The clock is visible as tissue-level kinematic waves of gene expression that travel through the presomitic mesoderm (PSM) and arrest at the position of each forming segment. Here, we test how this hallmark wave pattern is driven by culturing single maturing PSM cells. We compare their cell-autonomous oscillatory and arrest dynamics to those we observe in the embryo at cellular resolution, finding similarity in the relative slowing of oscillations and arrest in concert with differentiation. This shows that cell-extrinsic signals are not required by the cells to instruct the developmental program underlying the wave pattern. We show that a cell-autonomous timing activity initiates during cell exit from the tailbud, then runs down in the anterior-ward cell flow in the PSM, thereby using elapsed time to provide positional information to the clock. Exogenous FGF lengthens the duration of the cell-intrinsic timer, indicating extrinsic factors in the embryo may regulate the segmentation clock via the timer. In sum, our work suggests that a noisy cell-autonomous, intrinsic timer drives the slowing and arrest of oscillations underlying the wave pattern, while extrinsic factors in the embryo tune this timer’s duration and precision. This is a new insight into the balance of cell-intrinsic and -extrinsic mechanisms driving tissue patterning in development.

Abstract Multicellular systems grow over the course of weeks from single cells to tissues or even full organisms composed of several thousands of cells, making live imaging of such samples challenging. To bridge these wide spatiotemporal scales, we present an open top dual view and dual illumination light sheet microscope dedicated for live imaging of large specimens at single cell resolution. The novel configuration of objectives together with a flexible and customizable multi-well mounting system combines dual view with high throughput multi-position imaging. We use the newly developed microscope to image a wide variety of samples and highlight its capabilities to gain quantitative single-cell information in large specimens such as mature intestinal organoids and gastruloids.