Summary Emerging variants of concern for the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) can transmit more efficiently and partially evade protective immune responses, thus necessitating continued refinement of antibody therapies and immunogen design. Here we elucidate the structural basis and mode of action for two potent SARS-CoV-2 Spike (S) neutralizing monoclonal antibodies CV3-1 and CV3-25 that remained effective against emerging variants of concern in vitro and in vivo. CV3-1 bound to the (485-GFN-487) loop within the receptor-binding domain (RBD) in the “RBD-up” position and triggered potent shedding of the S1 subunit. In contrast, CV3-25 inhibited membrane fusion by binding to an epitope in the stem helix region of the S2 subunit that is highly conserved among β-coronaviruses. Thus, vaccine immunogen designs that incorporate the conserved regions in RBD and stem helix region are candidates to elicit pan-coronavirus protective immune responses.

ABSTRACT SARS-CoV-2, a betacoronavirus, is the cause of the COVID-19 pandemic. The SARS-CoV-2 spike (S) glycoprotein trimer mediates virus entry into host cells and cytopathic effects. We studied the contribution of several S glycoprotein features to these functions, focusing on those that differ among related coronaviruses. Acquisition of the furin cleavage site by the SARS-CoV-2 S glycoprotein decreased virus stability and infectivity, but greatly enhanced the ability to form lethal syncytia. Notably, the D614G change found in globally predominant SARS-CoV-2 strains restored infectivity, modestly enhanced responsiveness to the ACE2 receptor and susceptibility to neutralizing sera, and tightened association of the S1 subunit with the trimer. Apparently, two unique features of the SARS-CoV-2 S glycoprotein, the furin cleavage site and D614G, have evolved to balance virus infectivity, stability, cytopathicity and antibody vulnerability. Although the endodomain (cytoplasmic tail) of the S2 subunit was not absolutely required for virus entry or syncytium formation, alteration of palmitoylated cysteine residues in the cytoplasmic tail decreased the efficiency of these processes. As proteolytic cleavage contributes to the activation of the SARS-CoV-2 S glycoprotein, we evaluated the ability of protease inhibitors to suppress S glycoprotein function. Matrix metalloprotease inhibitors suppressed S-mediated cell-cell fusion, but not virus entry. Synergy between inhibitors of matrix metalloproteases and TMPRSS2 suggests that both proteases can activate the S glycoprotein during the process of syncytium formation. These results provide insights into SARS-CoV-2 S glycoprotein-host cell interactions that likely contribute to the transmission and pathogenicity of this pandemic agent. IMPORTANCE The development of an effective and durable SARS-CoV-2 vaccine is essential for combating the growing COVID-19 pandemic. The SARS-CoV-2 spike (S) glycoprotein is the main target of neutralizing antibodies elicited during virus infection or following vaccination. Knowledge of the spike glycoprotein evolution, function and interactions with host factors will help researchers to develop effective vaccine immunogens and treatments. Here we identify key features of the spike glycoprotein, including the furin cleavage site and the D614G natural mutation, that modulate viral cytopathic effects, infectivity and sensitivity to inhibition. We also identify two inhibitors of host metalloproteases that block S-mediated cell-cell fusion, which contributes to the destruction of the virus-infected cell.

ABSTRACT The SARS-CoV-2 coronavirus, the etiologic agent of COVID-19, uses its spike (S) glycoprotein anchored in the viral membrane to enter host cells. The S glycoprotein is the major target for neutralizing antibodies elicited by natural infection and by vaccines. Approximately 35% of the SARS-CoV-2 S glycoprotein consists of carbohydrate, which can influence virus infectivity and susceptibility to antibody inhibition. We found that virus-like particles produced by coexpression of SARS-CoV-2 S, M, E and N proteins contained spike glycoproteins that were extensively modified by complex carbohydrates. We used a fucose-selective lectin to enrich the Golgi-resident fraction of a wild-type SARS-CoV-2 S glycoprotein trimer, and determined its glycosylation and disulfide bond profile. Compared with soluble or solubilized S glycoproteins modified to prevent proteolytic cleavage and to retain a prefusion conformation, more of the wild-type S glycoprotein N-linked glycans are processed to complex forms. Even Asn 234, a significant percentage of which is decorated by high-mannose glycans on soluble and virion S trimers, is predominantly modified in the Golgi by processed glycans. Three incompletely occupied sites of O-linked glycosylation were detected. Viruses pseudotyped with natural variants of the serine/threonine residues implicated in O-linked glycosylation were generally infectious and exhibited sensitivity to neutralization by soluble ACE2 and convalescent antisera comparable to that of the wild-type virus. Unlike other natural cysteine variants, a Cys15Phe (C15F) mutant retained partial, but unstable, infectivity. These findings enhance our understanding of the Golgi processing of the native SARS-CoV-2 S glycoprotein carbohydrates and could assist the design of interventions.

ABSTRACT Binding to the receptor, CD4, drives the pretriggered, “closed” (State-1) conformation of the human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoprotein (Env) trimer into more “open” conformations (States 2 and 3). Broadly neutralizing antibodies, which are elicited inefficiently, mostly recognize the State-1 Env conformation, whereas the more commonly elicited poorly neutralizing antibodies recognize States 2/3. HIV-1 Env metastability has created challenges for defining the State-1 structure and developing immunogens mimicking this labile conformation. The availability of functional State-1 Envs that can be efficiently crosslinked at lysine and/or acidic amino acid residues might assist these endeavors. To that end, we modified HIV-1 AD8 Env, which exhibits an intermediate level of triggerability by CD4. We introduced lysine/acidic residues at positions that exhibit such polymorphisms in natural HIV-1 strains. Env changes that were tolerated with respect to gp120-gp41 processing, subunit association and virus entry were further combined. Two common polymorphisms, Q114E and Q567K, as well as a known variant, A582T, additively rendered pseudoviruses resistant to cold, soluble CD4 and a CD4-mimetic compound, phenotypes indicative of stabilization of the pretriggered State-1 Env conformation. Combining these changes resulted in two lysine-rich HIV-1 AD8 Env variants (E.2 and AE.2) with neutralization- and cold-resistant phenotypes comparable to those of natural, less triggerable Tier 2/3 HIV-1 isolates. Compared with these and the parental Envs, the E.2 and AE.2 Envs were cleaved more efficiently and exhibited stronger gp120-trimer association in detergent lysates. These highly crosslinkable Envs enriched in a pretriggered conformation should assist characterization of the structure and immunogenicity of this labile state. IMPORTANCE The development of an efficient vaccine is critical for combating HIV-1 infection worldwide. However, the instability of the pretriggered shape (State 1) of the viral envelope glycoprotein (Env) makes it difficult to raise neutralizing antibodies against HIV-1. Here, by introducing multiple changes in Env, we derived two HIV-1 Env variants that are enriched in State 1 and can be efficiently crosslinked to maintain this shape. These Env complexes are more stable in detergent, assisting their purification. Thus, our study provides a path to a better characterization of the native pretriggered Env, which should assist vaccine development.

ABSTRACT The functional human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoprotein (Env) trimer [(gp120/gp41) 3 ] is produced by cleavage of a conformationally flexible gp160 precursor. Gp160 cleavage or the binding of BMS-806, an entry inhibitor, stabilizes the pre-triggered, “closed” (State-1) conformation recognized by rarely elicited broadly neutralizing antibodies. Poorly neutralizing antibodies (pNAbs) elicited at high titers during natural infection recognize more “open” Env conformations (States 2 and 3) induced by binding the receptor, CD4. We found that BMS-806 treatment and crosslinking decreased the exposure of pNAb epitopes on cell-surface gp160; however, after detergent solubilization, crosslinked and BMS-806-treated gp160 sampled non-State-1 conformations that could be recognized by pNAbs. Cryo-electron microscopy of the purified BMS-806-bound gp160 revealed two hitherto unknown asymmetric trimer conformations, providing insights into the allosteric coupling between trimer opening and structural variation in the gp41 HR1 N region. The individual protomer structures in the asymmetric gp160 trimers resemble those of other genetically modified or antibody-bound cleaved HIV-1 Env trimers, which have been suggested to assume State-2-like conformations. Asymmetry of the uncleaved Env potentially exposes surfaces of the trimer to pNAbs. To evaluate the effect of stabilizing a State-1-like conformation of the membrane Env precursor, we treated cells expressing wild-type HIV-1 Env with BMS-806. BMS-806 treatment decreased both gp160 cleavage and the addition of complex glycans, implying that gp160 conformational flexibility contributes to the efficiency of these processes. Selective pressure to maintain flexibility in the precursor of functional Env allows the uncleaved Env to sample asymmetric conformations that potentially skew host antibody responses toward pNAbs. IMPORTANCE The envelope glycoprotein (Env) trimers on the surface of human immunodeficiency virus (HIV-1) mediate the entry of the virus into host cells and serve as targets for neutralizing antibodies. The functional Env trimer is produced by cleavage of the gp160 precursor in the infected cell. We found that the HIV-1 Env precursor is highly plastic, allowing it to assume different asymmetric shapes. This conformational plasticity is potentially important for Env cleavage and proper modification by sugars. Having a flexible, asymmetric Env precursor that can misdirect host antibody responses without compromising virus infectivity would be an advantage to a persistent virus like HIV-1.

The deposition of fly ash on the heat exchanger will reduce the heat transfer efficiency of the system. This article conducted experiments and simulations on the deposition, exploring the effects of velocity, particle size on the deposition position. In addition, deposition density distribution was demonstrated, the calculation method of fin thermal resistance was improved, and the efficiency of fins was also calculated. The results showed that deposition decreased with velocity increasing, and the simulation results were in good agreement with the experimental results. The deposition distribution of the first section of the fin is unimodal, and the maximum deposition value approaches the peak of the fin. The distribution of the second section of the fin becomes bimodal with increasing velocity. In addition, as the speed increases, due to the decrease in deposition mass, the thermal resistance decreases by 53.2% and the fin efficiency increases by 8.82%.

ABSTRACT The mature human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoprotein (Env) trimer, which consists of non-covalently associated gp120 exterior and gp41 transmembrane subunits, mediates virus entry into cells. The pretriggered (State-1) Env conformation is the major target for broadly neutralizing antibodies (bNAbs), whereas receptor-induced downstream Env conformations elicit immunodominant, poorly neutralizing antibody (pNAb) responses. To examine the contribution of membrane anchorage to the maintenance of the metastable pretriggered Env conformation, we compared wild-type and State-1-stabilized Envs solubilized in detergents or in styrene-maleic acid (SMA) copolymers. SMA directly incorporates membrane lipids and resident membrane proteins into lipid nanodiscs (SMALPs). The integrity of the Env trimer in SMALPs was maintained at both 4°C and room temperature. By contrast, Envs solubilized in Cymal-5, a non-ionic detergent, were unstable at room temperature, although their stability was improved at 4°C and after incubation with the entry inhibitor BMS-806. Envs solubilized in ionic detergents were relatively unstable at either temperature. Comparison of Envs solubilized in Cymal-5 and SMA at 4°C revealed subtle differences in bNAb binding to the gp41 membrane-proximal external region (MPER), consistent with these distinct modes of Env solubilization. Otherwise, the antigenicity of the Cymal-5- and SMA- solubilized Envs was remarkably similar, both in the absence and presence of BMS-806. However, both solubilized Envs were recognized differently from the mature membrane Env by specific bNAbs and pNAbs. Thus, detergent-based and detergent-free solubilization at 4°C alters the pretriggered membrane Env conformation in consistent ways, indicating that loss of Env association with the membrane results in default state(s). IMPORTANCE The human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoproteins (Envs) in the viral membrane mediate virus entry into the host cell and are targeted by neutralizing antibodies elicited by natural infection or vaccines. Detailed studies of membrane proteins rely on purification procedures that allow the proteins to maintain their natural conformation. In this study, we show that a styrene-maleic acid (SMA) copolymer can extract HIV-1 Env from a membrane without the use of detergents. The Env in SMA is more stable at room temperature than Env in detergents. The purified Env in SMA maintains many but not all of the characteristics expected of the natural membrane Env. Our results underscore the importance of the membrane environment to the native conformation of HIV-1 Env. Purification methods that bypass the need for detergents could be useful tools for future studies of HIV-1 Env structure and its interaction with receptors and antibodies.

ABSTRACT CD4-mimetic compounds (CD4mcs) bind the human immunodeficiency virus (HIV-1) gp120 exterior envelope glycoprotein (Env) and compete for binding to CD4, the host receptor. CD4mcs prematurely trigger conformational changes in Env similar to those induced by CD4, leading to transient activation of infectivity followed by irreversible virus inactivation. Natural HIV-1 variants exhibit a wide range of susceptibilities to CD4mc inhibition, only a small fraction of which can be explained by variation in the gp120 Phe-43 cavity/vestibule where CD4mcs bind. Here, we study Envs from the resistant HIV-1 BG505 and the more sensitive HIV-1 191955_A4 clade A strains. The major determinant of the relative sensitivity of the HIV-1 191955_A4 Env to CD4mcs mapped to a single residue change (F317Y) in the tip of the gp120 V3 variable loop. In the Envs of several HIV-1 strains, replacement of the more prevalent Phe 317 with a tyrosine residue increased virus sensitivity to multiple CD4mcs. Tryptophan substitutions at residues 317 and 316 resulted in increases and decreases, respectively, in sensitivity to CD4mcs. Some of the gp120 V3 changes increased virus sensitivity to inactivation by both CD4mc and cold exposure, phenotypes indicative of increased Env triggerability. Infection of CD4-negative cells expressing the CCR5 coreceptor by these Env variants was triggered more efficiently by CD4mcs. For the panel of studied HIV-1 Envs, resistance to the CD4mcs was associated with decreased ability to support virus entry. These studies illustrate how variation in gp120 outside the CD4mc binding site can influence the sensitivity of natural HIV-1 strains to inhibition by these compounds. IMPORTANCE CD4-mimetic compounds (CD4mcs) are small-molecule inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV-1) entry into host cells. CD4mcs target a pocket on the viral envelope glycoprotein (Env) spike that is used for binding to the receptor, CD4, and is highly conserved among HIV-1 strains. Nonetheless, naturally occurring HIV-1 strains exhibit a wide range of sensitivities to CD4mcs. Our study identifies changes distant from the binding pocket that can influence the susceptibility of natural HIV-1 strains to the antiviral effects of multiple CD4mcs. We relate the antiviral potency of the CD4mc against this panel of HIV-1 variants to the ability of the CD4mc to activate entry-related changes in Env conformation prematurely. These findings will guide efforts to improve the potency and breadth of CD4mcs against natural HIV-1 variants.

ABSTRACT The human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoprotein (Env) precursor (gp160) trimerizes, is modified by high-mannose glycans in the endoplasmic reticulum, and is transported via Golgi and non-Golgi secretory pathways to the infected cell surface. In the Golgi, gp160 is partially modified by complex carbohydrates and proteolytically cleaved to produce the mature functional Env trimer, which is preferentially incorporated into virions. Broadly neutralizing antibodies (bNAbs) generally recognize the cleaved Env trimer, whereas poorly neutralizing antibodies (pNAbs) bind the conformationally flexible gp160. We found that expression of bNAbs, pNAbs or soluble/membrane forms of the receptor, CD4, in cells producing HIV-1 all decreased viral infectivity. Four patterns of co-expressed ligand:Env were observed: 1) Ligands (CD4, soluble CD4-Ig and some pNAbs) that specifically recognize the CD4-bound Env conformation resulted in uncleaved Envs lacking complex glycans that were not incorporated into virions; 2) Other pNAbs produced Envs with some complex carbohydrates and severe defects in cleavage, which were relieved by brefeldin A treatment; 3) bNAbs that recognize gp160 as well as mature Envs resulted in Envs with some complex carbohydrates and moderate decreases in virion Env cleavage; and 4) bNAbs that preferentially recognize mature Envs produced cleaved Envs with complex glycans in cells and on virions. The low infectivity observed upon co-expression of pNAbs or CD4 could be explained by disruption of Env trafficking, reducing the level of Env and/or increasing the fraction of uncleaved Env on virions. In addition to bNAb effects on virion Env cleavage, the secreted bNAbs neutralized the co-expressed viruses. IMPORTANCE The envelope glycoprotein (Env) trimers on the human immunodeficiency virus (HIV-1) mediate virus entry into host cells. Env is synthesized in infected cells, modified by complex sugars and cleaved to form a mature, functional Env, which is incorporated into virus particles. Env elicits antibodies in infected individuals, some of which can neutralize the virus. We found that antibodies co-expressed in the virus-producing cell can disrupt Env transit to the proper compartment for cleavage and sugar modification and, in some cases, block incorporation into viruses. These studies provide insights into the processes by which Env becomes functional in the virus-producing cell and may assist attempts to interfere with these events to inhibit HIV-1 infection.