Antibodies are crucial to immune protection against SARS-CoV-2, with some in emergency use as therapeutics. Here, we identify 377 human monoclonal antibodies (mAbs) recognizing the virus spike and focus mainly on 80 that bind the receptor binding domain (RBD). We devise a competition data-driven method to map RBD binding sites. We find that although antibody binding sites are widely dispersed, neutralizing antibody binding is focused, with nearly all highly inhibitory mAbs (IC50 < 0.1 μg/mL) blocking receptor interaction, except for one that binds a unique epitope in the N-terminal domain. Many of these neutralizing mAbs use public V-genes and are close to germline. We dissect the structural basis of recognition for this large panel of antibodies through X-ray crystallography and cryoelectron microscopy of 19 Fab-antigen structures. We find novel binding modes for some potently inhibitory antibodies and demonstrate that strongly neutralizing mAbs protect, prophylactically or therapeutically, in animal models.

Vaccine development against the SARS-CoV-2 virus focuses on the principal target of the neutralizing immune response, the spike (S) glycoprotein. Adenovirus-vectored vaccines offer an effective platform for the delivery of viral antigen, but it is important for the generation of neutralizing antibodies that they produce appropriately processed and assembled viral antigen that mimics that observed on the SARS-CoV-2 virus. Here, we describe the structure, conformation and glycosylation of the S protein derived from the adenovirus-vectored ChAdOx1 nCoV-19/AZD1222 vaccine. We demonstrate native-like post-translational processing and assembly, and reveal the expression of S proteins on the surface of cells adopting the trimeric prefusion conformation. The data presented here confirms the use of ChAdOx1 adenovirus vectors as a leading platform technology for SARS-CoV-2 vaccines.

Summary Since the outbreak of the SARS-CoV-2 pandemic, there have been intense structural studies on purified recombinant viral components and inactivated viruses. However, investigation of the SARS-CoV-2 infection in the native cellular context is scarce, and there is a lack of comprehensive knowledge on SARS-CoV-2 replicative cycle. Understanding the genome replication, assembly and egress of SARS-CoV-2, a multistage process that involves different cellular compartments and the activity of many viral and cellular proteins, is critically important as it bears the means of medical intervention to stop infection. Here, we investigated SARS-CoV-2 replication in Vero cells under the near-native frozen-hydrated condition using a unique correlative multi-modal, multi-scale cryo-imaging approach combining soft X-ray cryo-tomography and serial cryoFIB/SEM volume imaging of the entire SARS-CoV-2 infected cell with cryo-electron tomography (cryoET) of cellular lamellae and cell periphery, as well as structure determination of viral components by subtomogram averaging. Our results reveal at the whole cell level profound cytopathic effects of SARS-CoV-2 infection, exemplified by a large amount of heterogeneous vesicles in the cytoplasm for RNA synthesis and virus assembly, formation of membrane tunnels through which viruses exit, and drastic cytoplasm invasion into nucleus. Furthermore, cryoET of cell lamellae reveals how viral RNAs are transported from double-membrane vesicles where they are synthesized to viral assembly sites; how viral spikes and RNPs assist in virus assembly and budding; and how fully assembled virus particles exit the cell, thus stablishing a model of SARS-CoV-2 genome replication, virus assembly and egress pathways.

Abstract While single-cell RNA sequencing provides a remarkable window on pathophysiologic tissue biology and heterogeneity, its high gene-dropout rate and low signal-to-noise ratio challenge quantitative analyses and mechanistic understanding. To address this issue, we developed PISCES, a platform for the network-based, single-cell analysis of mammalian tissue. PISCES accurately estimates the mechanistic contribution of regulatory and signaling proteins to cell state implementation and maintenance, based on the expression of their lineage-specific transcriptional targets, thus supporting discovery and visualization of Master Regulators of cell state and cell state transitions. Experimental validation assays, including by assessing concordance with antibody and CITE-Seq-based measurements, show significant improvement in the ability to identify rare subpopulations and to elucidate key lineage markers, compared to gene expression analysis. Systematic analysis of single cell profiles in the Human Protein Atlas (HPA) produced a comprehensive resource for human tissue studies, supporting fine-grain stratification of distinct cell states, molecular determinants, and surface markers.

Abstract Respiratory syncytial virus (RSV) is a leading cause of respiratory disease in infants and the elderly. In common with most viruses that replicate in the host cell cytoplasm, RSV induces the formation of cytoplasmic compartments within infected cells to sequester replicative processes from host countermeasures. The best characterised organelle formed during RSV infection is the inclusion body – the primary site of viral RNA synthesis - thought to form as a membrane-less biomolecular condensate. Fluorescence microscopy of cellular compartments using probes directed at the structural proteins of RSV and the intergenic regions of the RSV genome have identified a second class of organelles termed assembly granules. Here we use correlative microscopy to identify assembly granules in the cytoplasm of frozen hydrated RSV infected cells for imaging using cryogenic soft X-ray tomography and cryogenic electron tomography. We show that these compartments are membrane bound, enclosing large numbers of vesicles, some of which contain RSV ribonucleoprotein complexes. Further we show that these organelles are frequently adjacent to mitochondria and surrounded by ER-like membranes. We also observe vesicles connected by junctions suggesting mixing of contents and a mechanism for the different viral proteins to come together within the assembly granule prior to budding. Collectively, our data provides novel insights into the RSV assembly process.

Abstract In meiosis, cells undergo two sequential rounds of cell division, termed meiosis I and meiosis II. Textbook models of the meiosis I substage called pachytene show that nuclei have conspicuous 100-nm-wide, ladder-like synaptonemal complexes (SC), which form between homologous chromosomes. It remains unknown if cells have any other large, meiosis-specific nuclear structures. Here we present cryo-ET analysis of frozen-hydrated budding yeast cells before, during, and after pachytene. We found no evidence for the dense ladder-like structures expected of the SC or the ordered chromatin loops expected to project from their sides. Instead, we found large quantities of 12-nm-wide triple-helices that pack into crystalline bundles. These structures are present in meiotic cells, but not in interphase cells, so we call them meiotic triple helices (MTHs). MTHs are enriched in the nucleus but not enriched in the cytoplasm. Bundles of MTHs form at the same time as SCs in wild-type cells and also in mutant cells that are unable to form SCs. These results suggest that in yeast, SCs are not crystalline and that they coexist with large, previously unreported meiotic machines.

ABSTRACT Single-units were recorded in hippocampus, septum, and striatum while freely behaving rats (n=3) ran trials in a T-maze task, and rested in a holding bucket between trials. During periods of motor inactivity, SWRs triggered excitatory responses from 28% (64/226) and inhibitory responses from 14% (31/226) of septal neurons. By contrast, only 4% (14/378) of striatal neurons were excited and 6% (24/378) were inhibited during SWRs. In both structures, SWR-responsive neurons exhibited greater spike coherence with hippocampal theta rhythm than neurons that did not respond to SWRs. In septum, neurons that were excited by SWRs fired at late phases of the theta cycle, whereas neurons that were inhibited by SWRs fired at early phases of the theta cycle. By contrast, SWR-responsive striatal neurons did not show consistent phase preferences during the theta cycle. A subset of SWR-responsive neurons in septum (55/95) and striatum (26/38) behaved as speed cells , with firing rates that were positively or negatively modulated by the rat’s running speed. In both structures, firing rates of most SWR-excited speed cells were positively modulated by running speed, whereas firing rates of most SWR-inhibited speed cells were negatively modulated by running speed. These findings are consistent with a growing body of evidence that SWRs can activate subcortical representations of motor actions in conjunction with hippocampal representations of places and states, which may be important for storing and retrieving values of state-action pairs during reinforcement learning and memory consolidation.

Abstract A significant part of the human genome consists of endogenous retroviruses sequences. Human endogenous retrovirus K (HERV-K) is the most recently acquired endogenous retrovirus, is activated and expressed in many cancers and amyotrophic lateral sclerosis and possibly contributes to the aging process. To understand the molecular architecture of endogenous retroviruses, we determined the structure of immature HERV-K from native virus-like particles (VLPs) using cryo-electron tomography and subtomogram averaging (cryoET STA). The HERV-K VLPs show a greater distance between the viral membrane and immature capsid lattice, correlating with the presence of additional peptides, SP1 and p15, between the capsid (CA) and matrix (MA) proteins compared to the other retroviruses. The resulting cryoET STA map of the immature HERV-K capsid at 3.2 Å resolution shows a hexamer unit oligomerized through a 6-helix bundle which is further stabilized by a small molecule in the same way as the IP6 in immature HIV-1 capsid. The HERV-K immature CA hexamer assembles into the immature lattice via highly conserved dimmer and trimer interfaces, whose interactions were further detailed through all-atom molecular dynamics simulations and supported by mutational studies. A large conformational change mediated by the flexible linker between the N-terminal and the C-terminal domains of CA occurs between the immature and the mature HERV-K capsid protein, analogous to HIV-1. Comparison between HERV-K and other retroviral immature capsid structures reveals a highly conserved mechanism for the assembly and maturation of retroviruses across genera and evolutionary time.

Abstract Vaccines against SARS-CoV-2 have been proven to be an effective means of decreasing COVID-19 mortality, hospitalization rates, and transmission. One of the vaccines deployed worldwide is ChAdOx1 nCoV-19, which uses an adenovirus vector to drive the expression of the original SARS-CoV-2 spike on the surface of transduced cells. Using cryo-electron tomography and subtomogram averaging, we determined the native structures of the vaccine product expressed on cell surfaces in situ . We show that ChAdOx1-vectored vaccines expressing the Beta SARS-CoV-2 variant produce abundant native prefusion spikes predominantly in one-RBD-up conformation. Furthermore, the ChAdOx1 vectored HexaPro stabilized spike yields higher cell surface expression, enhanced RBD exposure, and reduced shedding of S1 compared to the wild-type. We demonstrate in situ structure determination as a powerful means for studying antigen design options in future vaccine development against emerging novel SARS-CoV-2 variants and broadly against other infectious viruses.