Summary Functional genomic strategies help to address the genotype phenotype problem by annotating gene function and regulatory networks. Here, we demonstrate that combining functional genomics with proteomics uncovers general principles of protein expression, and provides new avenues to annotate protein function. We recorded precise proteomes for all non-essential gene knock-outs in Saccharomyces cerevisiae. We find that protein abundance is driven by a complex interplay of i) general biological properties, including translation rate, turnover, and copy number variations, and ii) their genetic, metabolic and physical interactions, including membership in protein complexes. We further show that combining genetic perturbation with proteomics provides complementary dimensions of functional annotation: proteomic profiling, reverse proteomic profiling, profile similarity and protein covariation analysis. Thus, our study generates a resource in which nine million protein quantities are linked to 79% of the yeast coding genome, and shows that functional proteomics reveals principles that govern protein expression. Highlights - Nine million protein quantities recorded in ~4,600 non-essential gene deletions in S. cerevisiae reveal principles of how the proteome responds to genetic perturbation - Genome-scale protein expression is determined by both functional relationships between proteins, as well as common biological responses - Broad protein expression profiles in slow-growing strains can be explained by chromosomal aneuploidies - Protein half-life and ribosome occupancy are predictable from protein abundance changes across knock-outs - Functional proteomics annotates missing gene function in four complementary dimensions

Abstract Metabolism is fundamentally intertwined with the ageing process. We here report that a key determinant of cellular lifespan is not only nutrient supply and intracellular metabolism, but also metabolite exchange interactions that occur between cells. Studying chronological ageing in yeast, we observed that metabolites exported by young, exponentially growing, cells are re- imported during the stationary phase when cells age chronologically, indicating the existence of cross-generational metabolic interactions. We then used self-establishing metabolically cooperating communities (SeMeCos) to boost cell-cell metabolic interactions and observed a significant lifespan extension. A search for the underlying mechanisms, coupling SeMeCos, metabolic profiling, proteomics and genome-scale metabolic modelling, attributed a specific role to methionine consumer cells. These cells were enriched over time, adopted glycolytic metabolism and increased export of protective metabolites. Glycerol, in particular, accumulated in the communal metabolic environment and extended the lifespan of all cells in the community in a paracrine fashion. Our results hence establish metabolite exchange interactions as a determinant of the ageing process and show that metabolically cooperating cells shape their metabolic environment to achieve lifespan extension.

Summary Metal ions play crucial roles in cells, yet the broader impact of metal availability on biological networks remains underexplored. We generated genome-wide resources, systematically quantifying yeast cell growth, metallomic, proteomic, and genetic responses upon varying each of its essential metal ions (Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Mo, Na, Zn), over several orders of magnitude. We find that metal ions deeply impact cellular networks, with 57.6% of the proteome, including most signalling pathways, responding. While the biological response to each metal is distinct, our data reveals common properties of metal responsiveness, such as concentration interdependencies and metal homeostasis. We describe a compendium of metal-dependent cellular processes and reveal that several understudied genes can be functionally annotated based on their metal responses. Furthermore, we report that metalloenzymes occupy central nodes in the metabolic network and are more likely to be encoded by isozymes, resulting in system-wide responsiveness to metal availability.

Abstract The assimilation, incorporation, and metabolism of sulfur is a fundamental process across all domains of life, yet how cells deal with varying sulfur availability is not well understood. We studied an unresolved conundrum of sulfur fixation in yeast, in which an organosulfur-auxotrophy caused by deletion of homocysteine synthase Met17p is overcome when cells are inoculated at high cell density. We discovered that an uncharacterized gene YLL058Wp, herein named Hydrogen sulfide utilizing-1 ( HSU1 ), acts as a homocysteine synthase and allows the cells to substitute for Met17p by re-assimilating hydrosulfide ions leaked from met17Δ cells into O-acetyl-homoserine and forming homocysteine. Our results show that cells can cooperate to achieve sulfur fixation, indicating that the collective properties of microbial communities facilitate their basic metabolic capacity. Summary Sulfur limitation activates a dormant hydrogen sulfide fixation route via a novel homocysteine synthase Hsu1p (YLL058Wp).

Abstract Protein glycosylation is a complex and heterogeneous post-translational modification. Specifically, the human plasma proteome is rich in glycoproteins, and as protein glycosylation is frequently dysregulated in disease, glycoproteomics is considered an underexplored resource for biomarker discovery. Here, we present OxoScan-MS, a data-independent mass spectrometric acquisition technology and data analysis software that facilitates sensitive, fast, and cost-effective glycoproteome profiling of plasma and serum samples in large cohort studies. OxoScan-MS quantifies glycosylated peptide features by exploiting a scanning quadrupole to assign precursors to oxonium ions, glycopeptide-specific fragments. OxoScan-MS reaches a high level of sensitivity and selectivity in untargeted glycopeptide profiling, such that it can be efficiently used with fast microflow chromatography without a need for experimental enrichment of glycopeptides from neat plasma. We apply OxoScan-MS to profile the plasma glycoproteomic in an inpatient cohort hospitalised due to severe COVID-19, and obtain precise quantities for 1,002 glycopeptide features. We reveal that severe COVID-19 induces differential glycosylation in disease-relevant plasma glycoproteins, including IgA, fibrinogen and alpha-1-antitrypsin. Thus, with OxoScan-MS we present a strategy for quantitatively mapping glycoproteomes that scales to hundreds and thousands of samples, and report glycoproteomic changes in severe COVID-19.

Living systems integrate biochemical reactions that determine the functional state of each cell. Reactions are primarily mediated by proteins that have in systematic studies been treated as independent entities, disregarding their higher level organization into complexes which affects their activity and/or function and is thus of great interest for biological research. Here, we describe the implementation of an integrated technique to quantify cell state-specific changes in the physical arrangement of protein complexes, concurrently for thousands of proteins and hundreds of complexes. Applying this technique for comparison of human cells in interphase and mitosis, we provide a systematic overview of mitotic proteome reorganization. The results recall key hallmarks of mitotic complex remodeling and discover new events, such as a new model of nuclear pore complex disassembly, validated by orthogonal methods. To support the interpretation of quantitative SEC-SWATH-MS datasets, we extend the software CCprofiler and provide an interactive exploration tool, SECexplorer-cc .Highlights

Abstract The functions of cells and proteins depend on their biochemical microenvironment. To understand how biochemical constraints shaped protein structural evolution, we coupled the extensive genetic and metabolic data from the Saccharomycotina subphylum with the capability of AlphaFold2 to systematically predict protein structures from sequence. Determining how 11,269 enzyme structures catalysing 361 different metabolic reactions evolved over 400 million years alongside their molecular functions, we report that metabolism has shaped the structural evolution of enzymes at different levels: the organism’s overall metabolism; the topological organisation of the metabolic network; and each enzyme’s molecular properties. For example, structural evolution depends on each enzyme’s reaction mechanism, on the variability rather than the amount of metabolic flux, and on biosynthetic cost. Evolutionary cost-optimization is stronger on highly abundant enzymes and acts differently on different structural domains, with the exception of small-molecule binding sites, which are prioritised over other structural domains and lack cost-optimisation. Finally, while enzyme surfaces are less constrained, surface residues can also be exposed to positive selection for the co-evolution of protein-protein interaction sites. Accessing AlphaFold’s power to predict protein structures systematically and across species barriers, facilitating the integration of protein structures with functional genomics, we were thus able to map biological constraints which shape protein structural evolution at scale and over long timelines.