Summary

 The cistrome is the complete set of transcription factor (TF) binding sites (cis-elements) in an organism, while an epicistrome incorporates tissue-specific DNA chemical modifications and TF-specific chemical sensitivities into these binding profiles. Robust methods to construct comprehensive cistrome and epicistrome maps are critical for elucidating complex transcriptional networks that underlie growth, behavior, and disease. Here, we describe DNA affinity purification sequencing (DAP-seq), a high-throughput TF binding site discovery method that interrogates genomic DNA with in-vitro-expressed TFs. Using DAP-seq, we defined the Arabidopsis cistrome by resolving motifs and peaks for 529 TFs. Because genomic DNA used in DAP-seq retains 5-methylcytosines, we determined that >75% (248/327) of Arabidopsis TFs surveyed were methylation sensitive, a property that strongly impacts the epicistrome landscape. DAP-seq datasets also yielded insight into the biology and binding site architecture of numerous TFs, demonstrating the value of DAP-seq for cost-effective cistromic and epicistromic annotation in any organism.

This protocol describes DAP-seq, a transcription-factor binding site discovery assay that can be used to produce cistrome and epicistrome maps for any organism. To enable low-cost, high-throughput generation of cistrome and epicistrome maps for any organism, we developed DNA affinity purification sequencing (DAP-seq), a transcription factor (TF)-binding site (TFBS) discovery assay that couples affinity-purified TFs with next-generation sequencing of a genomic DNA library. The method is fast, inexpensive, and more easily scaled than chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). DNA libraries are constructed using native genomic DNA from any source of interest, preserving cell- and tissue-specific chemical modifications that are known to affect TF binding (such as DNA methylation) and providing increased specificity as compared with in silico predictions based on motifs from methods such as protein-binding microarrays (PBMs) and systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). The resulting DNA library is incubated with an affinity-tagged in vitro-expressed TF, and TF–DNA complexes are purified using magnetic separation of the affinity tag. Bound genomic DNA is eluted from the TF and sequenced using next-generation sequencing. Sequence reads are mapped to a reference genome, identifying genome-wide binding locations for each TF assayed, from which sequence motifs can then be derived. A researcher with molecular biology experience should be able to follow this protocol, processing up to 400 samples per week.

ABSTRACT Transformation is an indispensable tool for plant genetics and functional genomic studies. Although stable transformation no longer represents a major technology bottleneck in maize, there is still need for easily accessible and efficient transformation methods in most academic labs. Here we present the GGB transformation system, a rapid and highly efficient transformation system optimized for the immature embryo transformation of two maize genetic backgrounds, including the inbred line B104. The combination of distinct morphogenetic factors, the maize BABY BOOM transcriptional regulator (ZmBBM/EREB53) and the wheat GRF4-GIF1 (GROWTH REGULATING FACTOR4 - GRF-INTERACTING FACTOR1) chimera, together with a modified QuickCorn protocol, regenerated transformed maize seedlings in approximately two months with an efficiency of 26 to 37%; notably, the efficiency was 7-fold higher than with using either component in isolation. Additionally, ectopic expression of both morphogenetic factors did not show obvious effects on B104 development, and in particular fertility was not affected, obviating the need to remove the morphogenetic regulators post Agrobacterium infections. The GGB transformation system is designed for CRISPR-Cas9 editing but can be adapted for other purposes and should be easy to implement in most academic labs with little transformation experience.

SUMMARY Cis -regulatory elements (CREs) encode the genomic blueprints of spatiotemporal gene expression programs enabling highly specialized cell functions. To identify CREs at cell-type resolution in Zea mays , we implemented single-cell sequencing of Assay for Transposase Accessible Chromatin (scATAC-seq) in seedlings, embryonic roots, crown roots, axillary buds, and pistillate and staminate inflorescence. We describe 92 states of chromatin accessibility across 165,913 putative CREs and 52 known cell types. Patterns of transcription factor (TF) motif accessibility predicted cell identity with high accuracy, uncovered putative non-cell autonomous TFs, and revealed TF motifs underlying higher-order chromatin interactions. Comparison of maize and Arabidopsis thaliana developmental trajectories identified TF motifs with conserved patterns of accessibility. Cell type-specific CREs were enriched with enhancer activity, phenotype-associated genetic variants, and signatures of breeding-era selection. These data, along with companion software, Socrates , afford a comprehensive framework for understanding cellular heterogeneity, evolution, and cis -regulatory grammar of cell-type specification in a major crop.

SUMMARY WUSCHEL (WUS) is transcription factor vital for stem cell proliferation in plant meristems. In maize, ZmWUS1 is expressed in the inflorescence meristem, including the central zone, the reservoir of stem cells. ZmWUS1 overexpression in the Barren inflorescence3 mutant leads to defects in inflorescence development. Here, single-cell ATAC-seq analysis shows that ZmWUS1 overexpression alters chromatin accessibility throughout the central zone. The CAATAATGC motif, a known homeodomain recognition site, is predominantly observed in the regions with increased chromatin accessibility suggesting ZmWUS1 is an activator in the central zone. Regions with decreased chromatin accessibility feature various motifs and are adjacent to AUXIN RESPONSE FACTOR genes, revealing negative regulation of auxin signaling in the central zone. DAP-seq of ZmWUS1 identified the TGAATGAA motif, abundant in epidermal accessible chromatin compared to the central zone. These findings highlight ZmWUS1’s context-dependent mechanisms for stem cell maintenance in the inflorescence meristem.

SUMMARY Stem cells in plant shoots are a rare population of cells that produce leaves, fruits and seeds, vital sources for food and bioethanol. Uncovering regulators expressed in these stem cells will inform crop engineering to boost productivity. Single-cell analysis is a powerful tool for identifying regulators expressed in specific groups of cells. However, accessing plant shoot stem cells is challenging. Recent single-cell analyses of plant shoots have not captured these cells, and failed to detect stem cell regulators like CLAVATA3 and WUSCHEL . In this study, we finely dissected stem cell-enriched shoot tissues from both maize and arabidopsis for single-cell RNA-seq profiling. We optimized protocols to efficiently recover thousands of CLAVATA3 and WUSCHEL expressed cells. A cross-species comparison identified conserved stem cell regulators between maize and arabidopsis. We also performed single-cell RNA-seq on maize stem cell overproliferation mutants to find additional candidate regulators. Expression of candidate stem cell genes was validated using spatial transcriptomics, and we functionally confirmed roles in shoot development. These candidates include a family of ribosome-associated RNA-binding proteins, and two families of sugar kinase genes related to hypoxia signaling and cytokinin hormone homeostasis. These large-scale single-cell profiling of stem cells provide a resource for mining stem cell regulators, which show significant association with yield traits. Overall, our discoveries advance the understanding of shoot development and open avenues for manipulating diverse crops to enhance food and energy security.

ABSTRACT Machine learning approaches have been applied to identify transcription factor (TF)-DNA interaction important for gene regulation and expression. However, due to the enormous search space of the genome, it is challenging to build models capable of surveying entire reference genomes, especially in species where models were not trained. In this study, we surveyed a variety of methods for classification of epigenomics data in an attempt to improve the detection for 12 members of the Auxin Response Factor (ARF) binding DNAs from maize and soybean as assessed by DNA Affinity Purification and sequencing (DAP-seq). We used the classification for prediction by minimizing the genome search space by only surveying unmethylated regions (UMRs). For identification of DAP-seq binding events within the UMRs, we achieved 93.54% accuracy, 6.2% false positive, and a 43.29% false negative rate across 12 members of ARFs of maize on average by encoding DNA with count vectorization for k-mer with a logistic regression classifier with up-sampling and feature selection. Importantly, feature selection helps to uncover known and potentially novel ARF binding motifs. This demonstrates an independent method for identification of transcription factor binding sites. Finally, we tested the model built with maize DAP-seq data and applied it directly to the soybean genome and found unacceptably high false positive rates, which accounted for more than 40% across the ARF TFs tested. The findings in this study suggest the potential use of various methods to predict TF-DNA interactions within and between species with varying degrees of success.

Abstract Regulatory elements are important constituents of plant genomes that have shaped ancient and modern crops. Their identification, function, and diversity in crop genomes however are poorly characterized, thus limiting our ability to harness their power for further agricultural advances using induced or natural variation. Here, we use DNA affinity purification-sequencing (DAP-seq) to map transcription factor (TF) binding events for 200 maize TFs belonging to 30 distinct families and heterodimer pairs in two distinct inbred lines historically used for maize hybrid plant production, providing empirical binding site annotation for 5.3% of the maize genome. TF binding site comparison in B73 and Mo17 inbreds reveals widespread differences, driven largely by structural variation, that correlate with gene expression changes. TF binding site presence-absence variation helps clarify complex QTL such as vgt1 , an important determinant of maize flowering time, and DICE, a distal enhancer involved in herbivore resistance. Modification of TF binding regions via CRISPR-Cas9 mediated editing alters target gene expression and phenotype. Our functional catalog of maize TF binding events enables collective and comparative TF binding analysis, and highlights its value for agricultural improvement.