SUMMARY Recent advances in human blastoids generated from naïve pluripotent stem cells have opened a new avenue for modelling early human development and implantation. Despite the success, however, existing protocols have several limitations, e.g., the use of custom-built microwell arrays impedes wide adoption by the research community, and mass production of human blastoids is hampered by low-output or low-efficiency methods. To address these issues, here we developed an optimized protocol based on commercially available microwell plates, which enabled efficient generation of high-fidelity human blastoids at a large scale. Leveraging on the improved protocol, we identified MAPK. PI3K/AKT and mTOR signaling pathways were activated in both blastoids and blastocyst, and discovered endometrial stromal effects in promoting trophoblast cell survival, proliferation and syncytialization during extended co-culture with blastoids. Our optimized protocol will facilitate broader use of human blastoids as an accessible, perturbable, scalable, tractable, and ethical model for human blastocysts.

Faithful embryogenesis requires precise coordination between embryonic and extraembryonic tissues. Although stem cells from embryonic and extraembryonic origins have been generated for several mammalian species(Bogliotti et al., 2018; Choi et al., 2019; Cui et al., 2019; Evans and Kaufman, 1981; Kunath et al., 2005; Li et al., 2008; Martin, 1981; Okae et al., 2018; Tanaka et al., 1998; Thomson et al., 1998; Vandevoort et al., 2007; Vilarino et al., 2020; Yu et al., 2021b; Zhong et al., 2018), they are grown in different culture conditions with diverse media composition, which makes it difficult to study cross-lineage communication. Here, by using the same culture condition that activates FGF, TGF-β and WNT signaling pathways, we derived stable embryonic stem cells (ESCs), extraembryonic endoderm stem cells (XENs) and trophoblast stem cells (TSCs) from all three founding tissues of mouse and cynomolgus monkey blastocysts. This allowed us to establish embryonic and extraembryonic stem cell co-cultures to dissect lineage crosstalk during early mammalian development. Co-cultures of ESCs and XENs uncovered a conserved and previously unrecognized growth inhibition of pluripotent cells by extraembryonic endoderm cells, which is in part mediated through extracellular matrix signaling. Our study unveils a more universal state of stem cell self-renewal stabilized by activation, as opposed to inhibition, of developmental signaling pathways. The embryonic and extraembryonic stem cell co-culture strategy developed here will open new avenues for creating more faithful embryo models and developing more developmentally relevant differentiation protocols.