Abstract Actin filaments assemble into force-generating systems involved in diverse cellular functions, including cell motility, adhesion, contractility and division. It remains unclear how networks of actin filaments, which individually generate piconewton forces, can produce forces reaching tens of nanonewtons. Here we use in situ cryo-electron tomography to unveil how the nanoscale architecture of macrophage podosomes enables basal membrane protrusion. We show that the sum of the actin polymerization forces at the membrane is not sufficient to explain podosome protrusive forces. Quantitative analysis of podosome organization demonstrates that the core is composed of a dense network of bent actin filaments storing elastic energy. Theoretical modelling of the network as a spring-loaded elastic material reveals that it exerts forces of up to tens of nanonewtons, similar to those evaluated experimentally. Thus, taking into account not only the interface with the membrane but also the bulk of the network, is crucial to understand force generation by actin machineries. Our integrative approach sheds light on the elastic behavior of dense actin networks and opens new avenues to understand force production inside cells.

Sarcomeres, the basic contractile units of striated muscle, produce the forces driving muscular contraction through cross-bridge interactions between actin-containing thin filaments and myosin II-based thick filaments. Until now, direct visualization of the molecular architecture underlying sarcomere contractility has remained elusive. Here, we use in situ cryo-electron to-mography to unveil sarcomere contraction in frozen-hydrated neonatal rat cardiomyocytes. We show that the hexagonal lattice of the thick filaments is already established at the neonatal stage, with an excess of thin filaments outside the trigonal positions. Structural assessment of actin polarity by subtomogram averaging reveals that thin filaments in the fully activated state form overlapping arrays of opposite polarity in the center of the sarcomere. Our approach provides direct evidence for thin filament sliding during muscle contraction and may serve as a basis for structural understanding of thin filament activation and actomyosin interactions inside unperturbed cellular environments.

Abstract In most bacteria, division depends on a cytoskeletal structure, the Z ring, which serves as a scaffold for recruiting additional proteins, with which it forms the machinery responsible for division, the divisome. The detailed architecture of the ring, in particular the mechanisms of assembly, stabilization, and disassembly, are still largely unknown. Here, we highlight the role of FtsZ-associated proteins (Zaps) in stabilizing the Z ring by crosslinking the filaments. Among Zap proteins, ZapD binds the C-terminal domain of FtsZ, which serves as a hub for its regulation. We demonstrate that ZapD crosslinks FtsZ filaments in solution into toroidal structures formed by an arrangement of short, curved filaments. Using cryo-electron tomography combined with biochemical analysis, we reveal the three-dimensional organization of FtsZ within the toroids, shedding light on the crosslinking mechanism by ZapD. In spite of the compositional simplicity of our reconstituted system, the structural organization of the FtsZ polymers by ZapD appears to be compatible with the current model of the Z ring in the bacterial cell.

Abstract Cryo-electron tomography (cryo-ET) allows to visualize the cellular context at macromolecular level. To date, the impossibility of obtaining a reliable ground truth is limiting the application of deep learning-based image processing algorithms in this field. As a consequence, there is a growing demand of realistic synthetic datasets for training deep learning algorithms. In addition, besides assisting the acquisition and interpretation of experimental data, synthetic tomograms are used as reference models for cellular organization analysis from cellular tomograms. Current simulators in cryo-ET focus on reproducing distortions from image acquisition and tomogram reconstruction, however, they can not generate many of the low order features present in cellular tomograms. Here we propose several geometric and organization models to simulate low order cellular structures imaged by cryo-ET. Specifically, clusters of any known cytosolic or membrane bound macromolecules, membranes with different geometries as well as different filamentous structures such as microtubules or actin-like networks. Moreover, we use parametrizable stochastic models to generate a high diversity of geometries and organizations to simulate representative and generalized datasets, including very crowded environments like those observed in native cells. These models have been implemented in a multiplatform open-source Python package, including scripts to generate cryo-tomograms with adjustable sizes and resolutions. In addition, these scripts provide also distortion-free density maps besides the ground truth in different file formats for efficient access and advanced visualization. We show that such a realistic synthetic dataset can be readily used to train generalizable deep learning algorithms.

One of the challenges of bottom-up synthetic biology is the engineering of a minimal module for self-division of synthetic cells. To produce the contractile forces required for the controlled excision of cell-like compartments such as giant unilamellar vesicles (GUVs), reconstituted cytokinetic rings made of actin are considered to be among the most promising structures of a potential synthetic division machinery. Although the targeting of actin rings to GUV membranes and their myosin-induced constriction have been previously demonstrated, large-scale vesicle deformation has been precluded due to the lacking spatial control of these contractile structures. Here, we show the combined in vitro reconstitution of actomyosin rings and the bacterial MinDE protein system, effective in targeting E.coli Z-rings to mid-cell, within GUVs. Incorporating this spatial positioning tool, which induces active transport of any diffusible molecule on membranes, yields self-organized assembly of actomyosin rings at the equatorial plane of vesicles. Remarkably, the synergistic effect of Min oscillations and the contractile nature of actomyosin bundles induces mid-vesicle membrane deformation and striking bleb-like protrusions, leading to shape remodeling and symmetry breaking. Our system showcases how functional machineries from various organisms may be synergistically combined in vitro, leading to the emergence of new functionality towards a synthetic division system.

Abstract A key challenge for bottom-up synthetic biology is engineering a minimal module for self-division of synthetic cells. Actin-based cytokinetic rings are considered a promising structure to produce the forces required for the controlled excision of cell-like compartments such as giant unilamellar vesicles (GUVs). Despite prior demonstrations of actin ring targeting to GUV membranes and myosin-induced constriction, large-scale vesicle deformation has been precluded due to the lacking spatial control of these contractile structures. Here we show the combined reconstitution of actomyosin rings and the bacterial MinDE protein system within GUVs. Incorporating this spatial positioning tool, able to induce active transport of membrane-attached diffusible molecules, yields self-organized equatorial assembly of actomyosin rings in vesicles. Remarkably, the synergistic effect of Min oscillations and the contractility of actomyosin bundles induces mid-vesicle deformations and vesicle blebbing. Our system showcases how functional machineries from various organisms may be combined in vitro, leading to the emergence of functionalities towards a synthetic division system.