Intraluminal vesicles of multivesicular endosomes are either sorted for cargo degradation into lysosomes or secreted as exosomes into the extracellular milieu. The mechanisms underlying the sorting of membrane into the different populations of intraluminal vesicles are unknown. Here, we find that cargo is segregated into distinct subdomains on the endosomal membrane and that the transfer of exosome-associated domains into the lumen of the endosome did not depend on the function of the ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) machinery, but required the sphingolipid ceramide. Purified exosomes were enriched in ceramide, and the release of exosomes was reduced after the inhibition of neutral sphingomyelinases. These results establish a pathway in intraendosomal membrane transport and exosome formation.

We report the application of confocal imaging and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) to characterize chemically well-defined lipid bilayer models for biomembranes. Giant unilamellar vesicles of dilauroyl phosphatidylcholine/dipalmitoyl phosphatidylcholine (DLPC/DPPC)/cholesterol were imaged by confocal fluorescence microscopy with two fluorescent probes, 1,1′-dieicosanyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI-C 20 ) and 2-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza- s -indacene-3-pentanoyl)-1-hexadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (Bodipy-PC). Phase separation was visualized by differential probe partition into the coexisting phases. Three-dimensional image reconstructions of confocal z -scans through giant unilamellar vesicles reveal the anisotropic morphology of coexisting phase domains on the surface of these vesicles with full two-dimensional resolution. This method demonstrates by direct visualization the exact superposition of like phase domains in apposing monolayers, thus answering a long-standing open question. Cholesterol was found to induce a marked change in the phase boundary shapes of the coexisting phase domains. To further characterize the phases, the translational diffusion coefficient, D T , of the DiI-C 20 was measured by FCS. D T values at ∼25°C ranged from ∼ 3 × 10 −8 cm 2 /s in the fluid phase, to ∼ 2 × 10 −9 cm 2 /s in high-cholesterol-content phases, to ∼ 2 × 10 −10 cm 2 /s in the spatially ordered phases that coexist with fluid phases. In favorable cases, FCS could distinguish two different values of D T in a region of two-phase coexistence on a single vesicle.

The present paper describes a new experimental scheme for following diffusion and chemical reaction systems of fluorescently labeled molecules in the nanomolar concentration range by fluorescence correlation analysis.In the dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy provided here, the concentration and diffusion characteristics of two fluorescent species in solution as well as their reaction product can be followed in parallel.By using two differently labeled reaction partners, the selectivity to investigate the temporal evolution of reaction product is significantly increased compared to ordinary one-color fluorescence autocorrelation systems.Here we develop the theoretical and experimental basis for carrying out measurements in a confocal dual-beam fluorescence correlation spectroscopy setup and discuss conditions that are favorable for cross-correlation analysis.The measurement principle is explained for carrying out DNA-DNA renaturation kinetics with two differently labeled complementary strands.The concentration of the reaction product can be directly determined from the cross-correlation amplitude.

Multiphoton excitation (MPE) of fluorescent probes has become an attractive alternative in biological applications of laser scanning microscopy because many problems encountered in spectroscopic measurements of living tissue such as light scattering, autofluorescence, and photodamage can be reduced. The present study investigates the characteristics of two-photon excitation (2PE) in comparison with confocal one-photon excitation (1PE) for intracellular applications of fluorescence correlation spectroscopy (FCS). FCS is an attractive method of measuring molecular concentrations, mobility parameters, chemical kinetics, and fluorescence photophysics. Several FCS applications in mammalian and plant cells are outlined, to illustrate the capabilities of both 1PE and 2PE. Photophysical properties of fluorophores required for quantitative FCS in tissues are analyzed. Measurements in live cells and on cell membranes are feasible with reasonable signal-to-noise ratios, even with fluorophore concentrations as low as the single-molecule level in the sampling volume. Molecular mobilities can be measured over a wide range of characteristic time constants from approximately 10(-3) to 10(3) ms. While both excitation alternatives work well for intracellular FCS in thin preparations, 2PE can substantially improve signal quality in turbid preparations like plant cells and deep cell layers in tissue. At comparable signal levels, 2PE minimizes photobleaching in spatially restrictive cellular compartments, thereby preserving long-term signal acquisition.

In the bacterium Escherichia coli , the Min proteins oscillate between the cell poles to select the cell center as division site. This dynamic pattern has been proposed to arise by self-organization of these proteins, and several models have suggested a reaction-diffusion type mechanism. Here, we found that the Min proteins spontaneously formed planar surface waves on a flat membrane in vitro. The formation and maintenance of these patterns, which extended for hundreds of micrometers, required adenosine 5′-triphosphate (ATP), and they persisted for hours. We present a reaction-diffusion model of the MinD and MinE dynamics that accounts for our experimental observations and also captures the in vivo oscillations.

We have investigated the pH dependence of the dynamics of conformational fluctuations of green fluorescent protein mutants EGFP (F64L/S65T) and GFP-S65T in small ensembles of molecules in solution by using fluorescence correlation spectroscopy (FCS). FCS utilizes time-resolved measurements of fluctuations in the molecular fluorescence emission for determination of the intrinsic dynamics and thermodynamics of all processes that affect the fluorescence. Fluorescence excitation of a bulk solution of EGFP decreases to zero at low pH (pK a = 5.8) paralleled by a decrease of the absorption at 488 nm and an increase at 400 nm. Protonation of the hydroxyl group of Tyr-66, which is part of the chromophore, induces these changes. When FCS is used the fluctuations in the protonation state of the chromophore are time resolved. The autocorrelation function of fluorescence emission shows contributions from two chemical relaxation processes as well as diffusional concentration fluctuations. The time constant of the fast, pH-dependent chemical process decreases with pH from 300 μs at pH 7 to 45 μs at pH 5, while the time-average fraction of molecules in a nonfluorescent state increases to 80% in the same range. A second, pH-independent, process with a time constant of 340 μs and an associated fraction of 13% nonfluorescent molecules is observed between pH 8 and 11, possibly representing an internal proton transfer process and associated conformational rearrangements. The FCS data provide direct measures of the dynamics and the equilibrium properties of the protonation processes. Thus FCS is a convenient, intrinsically calibrated method for pH measurements in subfemtoliter volumes with nanomolar concentrations of EGFP.

We report on the successful application of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) to the analysis of single fluorescently labeled lipid analogue molecules diffusing laterally in lipid bilayers, as exemplified by time traces of fluorescence bursts of individual molecules entering and leaving the excitation area. FCS measurements performed on lipid probes in rat basophilic leukemia cell membranes showed deviations from two-dimensional Brownian motion with a single uniform diffusion constant. Giant unilamellar vesicles were employed as model systems to characterize diffusion of fluorescent lipid analogues in both homogeneous and mixed lipid phases with diffusion heterogeneity. Comparing the results of cell membrane diffusion with the findings on the model systems suggests possible explanations for the observations: (a) anomalous subdiffusion in which evanescent attractive interactions with disparate mobile molecules modifies the diffusion statistics; (b) alternatively, probe molecules are localized in microdomains of submicroscopic size, possibly in heterogeneous membrane phases. Cytometry 36:176–182, 1999. © 1999 Wiley-Liss, Inc.

Confocal fluorescence microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) have been employed to investigate the lipid spatial and dynamic organization in giant unilamellar vesicles (GUVs) prepared from ternary mixtures of dioleoyl-phosphatidylcholine/sphingomyelin/cholesterol. For a certain range of cholesterol concentration, formation of domains with raft-like properties was observed. Strikingly, the lipophilic probe 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI-C18) was excluded from sphingomyelin-enriched regions, where the raft marker ganglioside GM1 was localized. Cholesterol was shown to promote lipid segregation in dioleoyl-phosphatidylcholine-enriched, liquid-disordered, and sphingomyelin-enriched, liquid-ordered phases. Most importantly, the lipid mobility in sphingomyelin-enriched regions significantly increased by increasing the cholesterol concentration. These results pinpoint the key role, played by cholesterol in tuning lipid dynamics in membranes. At cholesterol concentrations >50 mol%, domains vanished and the lipid diffusion slowed down upon further addition of cholesterol. By taking the molecular diffusion coefficients as a fingerprint of membrane phase compositions, FCS is proven to evaluate domain lipid compositions. Moreover, FCS data from ternary and binary mixtures have been used to build a ternary phase diagram, which shows areas of phase coexistence, transition points, and, importantly, how lipid dynamics varies between and within phase regions. Confocal fluorescence microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS) have been employed to investigate the lipid spatial and dynamic organization in giant unilamellar vesicles (GUVs) prepared from ternary mixtures of dioleoyl-phosphatidylcholine/sphingomyelin/cholesterol. For a certain range of cholesterol concentration, formation of domains with raft-like properties was observed. Strikingly, the lipophilic probe 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI-C18) was excluded from sphingomyelin-enriched regions, where the raft marker ganglioside GM1 was localized. Cholesterol was shown to promote lipid segregation in dioleoyl-phosphatidylcholine-enriched, liquid-disordered, and sphingomyelin-enriched, liquid-ordered phases. Most importantly, the lipid mobility in sphingomyelin-enriched regions significantly increased by increasing the cholesterol concentration. These results pinpoint the key role, played by cholesterol in tuning lipid dynamics in membranes. At cholesterol concentrations >50 mol%, domains vanished and the lipid diffusion slowed down upon further addition of cholesterol. By taking the molecular diffusion coefficients as a fingerprint of membrane phase compositions, FCS is proven to evaluate domain lipid compositions. Moreover, FCS data from ternary and binary mixtures have been used to build a ternary phase diagram, which shows areas of phase coexistence, transition points, and, importantly, how lipid dynamics varies between and within phase regions. More than 10 years ago, the hypothesis was formulated that cellular membranes are organized in discrete dynamic entities, called lipid rafts (1Simons K. van Meer G. Biochemistry. 1988; 27: 6197-6202Crossref PubMed Scopus (1119) Google Scholar, 2Sankaram M.B. Thompson T.E. Biochemistry. 1990; 29: 10670-10675Crossref PubMed Scopus (295) Google Scholar). Studies on epithelial cell polarity revealed that lipids, in particular sphingolipids and cholesterol, were laterally organized in the exoplasmic leaflet of the apical plasma membrane according to a variable short and long range order. Furthermore, distinct proteins were shown to selectively partition into lipid rafts, indicating that rafts could serve as specific sites for molecular sorting and polarized transport. They also function as platforms for intra- and intercellular signaling (3Simons K. Ikonen E. Nature. 1997; 387: 569-572Crossref PubMed Scopus (8271) Google Scholar, 4Brown D.A. London E. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998; 14: 111-136Crossref PubMed Scopus (2569) Google Scholar), e.g. in T-cells and basophils (5Robinson P.J. Immunol. Today. 1991; 12: 35-41Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (248) Google Scholar, 6Stulnig T.M. Berger M. Sigmund T. Stockinger H. Horejsi V. J. Biol. Chem. 1997; 272: 19242-19247Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (109) Google Scholar, 7Germain R.N. Curr. Biol. 1997; 7: R640-R644Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar, 8Field K.A. Holowka D. Baird B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 9201-9205Crossref PubMed Scopus (275) Google Scholar, 9Field K.A. Holowka D. Baird B. J. Biol. Chem. 1997; 272: 4276-4280Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (327) Google Scholar, 10Sheets E.D. Holowka D. Baird B. J. Cell Biol. 1999; 145: 877-887Crossref PubMed Scopus (294) Google Scholar), and play an important role in sorting, occurring in the trans-Golgi network of polarized epithelial cells (1Simons K. van Meer G. Biochemistry. 1988; 27: 6197-6202Crossref PubMed Scopus (1119) Google Scholar, 11Brown D.A. Rose J.K. Cell. 1992; 68: 533-544Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2646) Google Scholar, 12Ikonen E. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 470-477Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar) and neurons (13Dotti C.G. Parton R.G. Simons K. Nature. 1991; 349: 158-161Crossref PubMed Scopus (207) Google Scholar), as well as in pathways originating from the cell surface, i.e. involving caveolae (14Anderson R.G. Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 199-225Crossref PubMed Scopus (1739) Google Scholar, 15Smart E.J. Anderson R.G. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 7289-7304Crossref PubMed Scopus (929) Google Scholar) and endocytic pathways (3Simons K. Ikonen E. Nature. 1997; 387: 569-572Crossref PubMed Scopus (8271) Google Scholar, 12Ikonen E. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: 470-477Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar, 16Bretscher M.S. Munro S. Science. 1993; 261: 1280-1281Crossref PubMed Scopus (751) Google Scholar). In addition, rafts may be important in cell surface proteolysis (17Sevinsky J.R. Rao L.V.M. Ruf W. J. Cell Biol. 1996; 133: 293-304Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar) and virus infection (18Stang E. Kartenbeck J. Parton R.G. Mol. Biol. Cell. 1997; 8: 47-57Crossref PubMed Scopus (218) Google Scholar). Commonly, lipid rafts are enriched in sphingolipids and cholesterol (1Simons K. van Meer G. Biochemistry. 1988; 27: 6197-6202Crossref PubMed Scopus (1119) Google Scholar, 2Sankaram M.B. Thompson T.E. Biochemistry. 1990; 29: 10670-10675Crossref PubMed Scopus (295) Google Scholar, 3Simons K. Ikonen E. Nature. 1997; 387: 569-572Crossref PubMed Scopus (8271) Google Scholar, 4Brown D.A. London E. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1998; 14: 111-136Crossref PubMed Scopus (2569) Google Scholar). The presence of long and saturated acyl chains in sphingolipids allows cholesterol to become tightly intercalated with such lipids, resulting in the organization of liquid-ordered (lo) phases. By contrast, unsaturated phospholipids are loosely packed and form a disordered state (usually indicated as liquid crystalline lc or liquid-disordered ld) (19Brown D.A. London E. J. Biol. Chem. 2000; 275: 17221-17224Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2080) Google Scholar, 20Schmidt C.F. Barenholz Y. Huang C. Thompson T.E. Nature. 1978; 271: 775-777Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar). The difference in packing ability leads to phase separation (21Fridriksson E.K. Biochemistry. 1999; 38: 8056-8063Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar, 22Brown R.E. J. Cell Sci. 1998; 111: 1-9Crossref PubMed Google Scholar). Model membrane studies carried out on ternary mixtures of cholesterol with phospholipids and sphingolipids show that lo phases, enriched in sphingolipids, separate from ld phases, enriched in phospholipids (19Brown D.A. London E. J. Biol. Chem. 2000; 275: 17221-17224Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2080) Google Scholar, 23Brown D.A. London E. J. Membr. Biol. 1998; 164: 103-114Crossref PubMed Scopus (850) Google Scholar). Several observations indicate that these “artificial rafts” are a reasonable, though crude, model of raft-containing cell membranes (24Brown D.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 10517-10518Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). More recently, along with a number of techniques employed to address questions on rafts (11Brown D.A. Rose J.K. Cell. 1992; 68: 533-544Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2646) Google Scholar, 21Fridriksson E.K. Biochemistry. 1999; 38: 8056-8063Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar, 25Heerklotz H. Biophys. J. 2002; 83: 2693-2701Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (476) Google Scholar, 26Wilson B.S. Pfeiffer J.R. Oliver J.M. J. Cell Biol. 2000; 149: 1131-1142Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar, 27Varma R. Mayor S. Nature. 1998; 394: 798-801Crossref PubMed Scopus (1044) Google Scholar), important contributions have also come from optical microscopy (28Kenworthy A.K. Petranova N. Edidin M. Mol. Biol. Cell. 2000; 11: 1645-1655Crossref PubMed Scopus (394) Google Scholar, 29Schütz G.J. Kada G. Pastushenko V.P. Schindler H. EMBO J. 2000; 19: 892-901Crossref PubMed Scopus (489) Google Scholar). Direct visualization of raft-like domains in model bilayer membranes has provided a tangible proof for the coexistence of liquid-ordered and liquid-disordered phases (30Bagatolli L.A. Gratton E. Biophys. J. 2000; 78: 290-305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (333) Google Scholar, 31Dietrich C. Bagatolli L.A. Volovyk Z.N. Thompson N.L. Levi M. Jacobson K. Gratton E. Biophys. J. 2001; 80: 1417-1428Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1217) Google Scholar, 32Dietrich C. Volovyk Z.N. Levi M. Thompson N.L. Jacobson K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 10642-10647Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar, 33Samsonov A.V. Mihalyov I. Cohen F.C. Biophys. J. 2001; 81: 1486-1500Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (400) Google Scholar). However, rafts are by no means static structures. If it is true that their main function consists of forming platforms to concentrate certain proteins, then a detailed characterization of lipid and protein dynamics in the different phases is essential to understand mobility-dependent protein organization (34Simons K. Toomre D. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000; 1: 31-39Crossref PubMed Scopus (5252) Google Scholar). Single particle tracking (SPT) has been applied to follow raft-associated proteins in vivo (29Schütz G.J. Kada G. Pastushenko V.P. Schindler H. EMBO J. 2000; 19: 892-901Crossref PubMed Scopus (489) Google Scholar) and lipid mobility in cell membranes and in vitro (31Dietrich C. Bagatolli L.A. Volovyk Z.N. Thompson N.L. Levi M. Jacobson K. Gratton E. Biophys. J. 2001; 80: 1417-1428Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1217) Google Scholar, 35Fujiwara T. Ritchie K. Murakoshi H. Jacobson K. Kusumi A. J. Cell Biol. 2002; 157: 1071-1081Crossref PubMed Scopus (761) Google Scholar). Additional contributions have come from fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) (32Dietrich C. Volovyk Z.N. Levi M. Thompson N.L. Jacobson K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 10642-10647Crossref PubMed Scopus (306) Google Scholar) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) (28Kenworthy A.K. Petranova N. Edidin M. Mol. Biol. Cell. 2000; 11: 1645-1655Crossref PubMed Scopus (394) Google Scholar). However, a detailed characterization of cholesterol-containing membranes from a dynamic point of view is still lacking. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) 1The abbreviations used are: FCS, fluorescence correlation spectroscopy; GUVs, giant unilamellar vesicles; LUVs, large unilamellar vesicles; DOPC, l-α-dioleoyl-phosphatidylcholine; SM, N-stearoyl-d-erythrosphingosylphosphorylcholine; DiI-C18, 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; MβCD, methyl-β-cyclodextrin; ITO, indium tin oxide. is based on the time-correlation of temporal fluorescence fluctuations detected in the focal volume, which are governed by dynamic parameters of the system at equilibrium (36Eigen M. Rigler R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5740-5747Crossref PubMed Scopus (914) Google Scholar, 37Schwille P. Cell Biochem. Biophys. 2001; 34: 383-408Crossref PubMed Scopus (310) Google Scholar). The power of FCS relies on the single molecule sensitivity and the capability of exploring a wide range of dynamic events with high temporal resolution and good statistical accuracy (38Koppel D.E. Phys. Rev. A. 1974; 10: 1938-1945Crossref Scopus (384) Google Scholar). In the past, this technique has been proven to be a powerful tool to follow lipid dynamics in domain-forming giant unilamellar vesicles (GUVs) (39Korlach J. Schwille P. Webb W.W. Feigenson G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 8461-8466Crossref PubMed Scopus (731) Google Scholar), which serve as excellent model membranes for single molecule optical microscopy (40Angelova M.I. Dimitrov D.S. Faraday Discuss. Chem. Soc. 1986; 81: 303-308Crossref Google Scholar). In this study, we present a detailed characterization of lipid dynamics in raft-forming GUVs prepared from a ternary mixture of cholesterol, dioleoyl-phosphatidylcholine, and sphingomyelin. By combining confocal optical microscopy and FCS, insight is gained in the static and dynamic organization of lipids, partitioning in different phases. It is evident that cholesterol plays a key role in promoting raft formation and, most importantly, in tuning membrane lipid mobility. Finally, we show that FCS provides information on lipid raft composition, allowing for a mapping of the lipid phase diagram, entirely based on dynamic parameters. Chemicals—1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (dioleoyl-phosphatidylcholine; DOPC), N-stearoyl-d-erythrosphingosylphosphorylcholine (stearoyl sphingomyelin, SM), cholesterol, porcine brain ganglioside GM1 (GM1) were purchased from Avanti Polar Lipids. 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiIC18) and the Alexa-Fluor 488 conjugate of cholera toxin B subunit (AF-CTB) were from Molecular Probes. The cholesterol-sequestering agent methyl-β-cyclodextrin (MβCD) was from Sigma. All other chemicals were of reagent grade. Preparation of GUVs—GUVs were prepared by electroformation (40Angelova M.I. Dimitrov D.S. Faraday Discuss. Chem. Soc. 1986; 81: 303-308Crossref Google Scholar, 41Dimitrov D.S. Angelova M.I. Bioelectrochem. Bioenerg. 1988; 19: 323-333Crossref Scopus (127) Google Scholar). With this approach, truly unilamellar vesicles are produced with sizes varying from 10 up to 100 μm (42Menger F.M. Angelova M.I. Acc. Chem. Res. 1998; 31: 789-797Crossref Scopus (214) Google Scholar, 43Mathivet L. Cribier S. Devaux P.F. Biophys. J. 1996; 70: 1112-1121Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar). The flow chamber (closed-bath perfusion chamber, RC-21, Warner Instruments Co.) used for vesicle preparation was equipped with two microscope slides, each coated with optically transparent and electrically conductive indium tin oxide (ITO). Lipids in chloroform/methanol 9:1 (5 mm, prepared freshly and kept under a nitrogen atmosphere) were deposited on preheated ITO coverslips and the solvent was evaporated at 20 or 60 °C; both procedures yielded the same results in terms of domain formation and lipid mobility. After adding water into the chamber (∼300 μl), a voltage of 1.1 V at 10 Hz was applied for 1 h. After lipid swelling, the chamber was put either directly at room temperature or cooled down slowly by using a heat block. Both cooling procedures led to the same type of vesicles and domain pattern. Also the presence of the reducing agent dithiothreitol (2 mm, final concentration), to prevent possible lipid oxidation, did not affect domain formation and lipid mobility under our conditions of GUV formation. Whatever procedure was used, the GUVs were always prepared from fresh lipid mixtures and kept under a nitrogen atmosphere as much as possible. Lipids were checked for oxidation by UV/VIS spectroscopy and thin layer chromatography. Under the conditions of GUV preparation, it was found that less than 0.1% of lipids were oxidized. DiI-C18 was added in the amount of 0.1 mol% for confocal imaging and 0.001 mol% for FCS. Since GM1 is known to change the lipid spatial distribution above 2 mol% (44Magde D. Elson E. Webb W.W. Phys. Rev. Lett. 1972; 29: 705-708Crossref Scopus (1502) Google Scholar, 45Spink C.H. Yeager M.D. Feigenson G.W. Biochim. Biophys. Acta. 1990; 1023: 25-33Crossref PubMed Scopus (99) Google Scholar), the compound was used here in minimal amounts, for confocal imaging (0.1 mol%) and FCS (0.05 mol%). Confocal Fluorescence Microscopy and FCS—Confocal fluorescence microscopy and FCS were performed on a commercial ConfoCor2 (Zeiss, Jena, Germany). Confocal images were taken with the laser scanning microscopy (LSM) module. The excitation light of an Ar ion laser at 488 nm and of a HeNe laser at 543 nm was reflected by a dichroic mirror (HFT 488/543) and focused through a Zeiss C-Apochromat 40×, NA = 1.2 water immersion objective onto the sample. The fluorescence emission was recollected by the same objective and split by another dichroic mirror (NFT 545) into two channels. Detection of the fluorescence emission, after passing a 505–530-nm bandpass filter in the first channel and a 560-nm longpass filter in the second channel, was obtained with two photomultipliers (PMTs). The confocal geometry was ensured by pinholes (60 μm) in front of the PMTs. FCS measurements were performed by epi-illuminating the sample with the 543 nm HeNe laser (I ex ≈ 1.2 kW/cm2). The excitation light was reflected by a dichroic mirror (HTF 543) and focused onto the sample by the same objective as for the LSM. The fluorescence emission was recollected back and sent to an avalanche photodiode via a 560–615-nm bandpass filter. Out-of-plane fluorescence was reduced by a pinhole (90 μm) in front of the detector. The laser focus was positioned on the topside/bottomside of GUVs, by performing an axial (z-) scan through the membrane prior to the FCS recording. The fluorescence temporal signal was recorded and the autocorrelation function G(τ) was calculated, according to Magde et al. (44Magde D. Elson E. Webb W.W. Phys. Rev. Lett. 1972; 29: 705-708Crossref Scopus (1502) Google Scholar). The apparatus was calibrated by measuring the known three-dimensional diffusion coefficient of rhodamine in solution. The detection area on the focal plane was approximated to a Gaussian profile and had a radius of ≈0.18 μm at 1/e2 relative intensity. Data fitting was performed with the Levenberg-Marquardt nonlinear least-squares fit algorithm (ORIGIN, OriginLab, Northampton, MA). The fitting equation made use of a two-dimensional Brownian diffusion model, assuming a Gaussian beam profile as shown in Equation 1, G(τ)=∑i〈Ci〉11+τ/τd,iAeff∑i〈Cl〉2,(Eq. 1) where 〈Ci〉 is the two-dimensional time average concentration of the species i in the detection area A eff and τd,i is the average residence time of the species i. The diffusion coefficient D i for the species i is proportional to τd,i. For FCS measurements, three independent GUVs preparations were analyzed and, for each of them, data from at least 20 different GUVs were recorded with 100 s acquisition time per FCS measurement. When membrane phase separation was visualized with the LSM, the laser focus was always positioned onto one phase only for the FCS experiment. Lipid Domain Visualization by Confocal Fluorescence Microscopy—Confocal fluorescence microscopy was employed to visualize phase separation in GUVs prepared from SM/DOPC/cholesterol and imaged at room temperature. We exploited the ability of a fluorescent marker, DiI-C18, to partition differently in such type of domains. DiI-C18 has been used in mixtures of saturated phospholipids and shown to partition preferentially with saturated, long-tailed phospholipids, e.g. dipalmitoyl-phosphatidylcholine-phases over coexisting fluid phases by a factor of ∼3 (45Spink C.H. Yeager M.D. Feigenson G.W. Biochim. Biophys. Acta. 1990; 1023: 25-33Crossref PubMed Scopus (99) Google Scholar). We show here that DiI-C18 is excluded from the sphingolipid-rich phase and rather favors the DOPC-rich phase. The unambigous phase assignment was carried out by determining the partitioning of GM1, a ganglioside frequently used to identify sphingolipid-enriched rafts (46Harder T. Scheiffele P. Verkade P. Simons K. J. Cell Biol. 1998; 141: 929-942Crossref PubMed Scopus (1054) Google Scholar). Upon incubation of GUVs with the AlexaFluor conjugate of cholera toxin B subunit (AF-CTB), for which GM1 is the natural receptor, the complex GM1-CTB was detected only in areas from which DiI-C18 was strongly excluded (SM-enriched). Fig. 1 shows a series of confocal images of GUVs with different lipid compositions and well illustrates the lipid organization and domain morphology when the fraction of cholesterol is varied. GUVs made of pure DOPC exhibited uniform DiI-C18 fluorescence (Fig. 1A). Here, the lipids were in the fluid phase at room temperature, as following photobleaching of a spot, a quick recovery of fluorescence was observed. GUVs prepared from pure SM were, within the optical resolution, also uniformly fluorescent, but in this case the membrane was in the solid state, at room temperature. Consistently, following photobleaching, no significant recovery of fluorescence was observed within hours (see Fig. 1B). Uniform fluorescence was also observed in bilayers formed from DOPC/SM (0.5/0.5 molar ratio) (not shown). However, inclusion of as little as 10 mol% of cholesterol in the SM/DOPC (0.5/0.5) bilayer, sufficed to induce lipid segregation, as evidenced by the preferential partitioning of DiI-C18 in one phase (red areas in Fig. 1C). Strikingly, the marker partitioned in the fluid-disordered phase by a factor of ∼50, assuming the quantum efficiency of DiI-C18 was the same in both lipid phases. Alexa-Fluor-labeled cholera toxin AF-CTB bound to areas in the GUVs, from which DiI-C18 was excluded and formed fluorescent regions exactly complementary to the ones covered by DiI-C18 (green areas in Fig. 1C). The size of SM-enriched domains could vary from a few microns up to a size covering almost half of a 20 μm-sized GUV. Unilamellarity of the vesicles allowed us to look for phase interlayer coupling and it was found that, in all of the GUVs, the phase domains comprised both apposing membrane leaflets. Phase separation was also visualized at higher amounts of cholesterol (SM/DOPC = 0.5/0.5), as shown in Fig. 1D for 20 mol% and in Fig. 1E for 33 mol% of cholesterol. The domain morphology was the same as described for 10 mol% cholesterol, except that the total surface area of the SM-enriched phase increased with the amount of cholesterol. At 50 mol% cholesterol, rafts were no longer observed within the optical resolution (Fig. 1F). Similarly, uniform fluorescence from DiI-C18 and GM1-bound AF-CTB was detected in GUVs with 65 mol% cholesterol (not shown). Membrane Lipid Mobility Is Controlled by Cholesterol—We assessed the membrane lipid mobility of GUVs made from ternary mixtures of DOPC/SM/cholesterol by measuring the diffusion coefficient of DiI-C18 by FCS. In Fig. 2A, correlation curves are shown for the liquid-disordered, DOPC-enriched domain, where DiI-C18 preferentially partitioned, and in Fig. 2B those for the liquid-ordered, SM-enriched domain, from which DiI-C18 was largely excluded. Note that the sensitivity of FCS allows one to measure lipid diffusion with the fluorescent marker at very low concentrations in both phases. As soon as phase separation occurred, in the presence of 10 mol% of cholesterol (Fig. 2A, dash (d)), the lipid mobility in liquid-disordered domains (D = 4.9 ± 0.3 × 10–8 cm2/s) almost matched the one of pure DOPC membranes (D = 6.3 ± 0.2 × 10–8 cm2/s, Fig. 2A, dot (a)). This mobility was significantly higher than that measured in DOPC/SM (0.5/0.5) GUVs in the absence of cholesterol (D = 2.6 ± 0.2 × 10–8 cm2/s, Fig. 2A, solid (e)). An increase in the cholesterol concentration hardly affected the mobility value of DiI-C18 relative to values measured for pure DOPC. On the other hand, cholesterol greatly varied the lipid mobility in the SM-enriched phase (Fig. 2B), where lipid diffusion was significantly slower than in the fluid-disordered phase and in the SM/DOPC (0.5/0.5) mixture without cholesterol (Fig. 2B, solid (a)). However, by increasing the amount of cholesterol, the membrane lipid mobility in SM-enriched domains greatly increased, from D = 0.105 ± 0.031 × 10–8 cm2/s (10 mol% cholesterol, Fig. 2B, dash (f)) up to D = 0.795 ± 0.108 × 10–8 cm2/s (33 mol% cholesterol, Fig. 2B, dash dot dot (d)) approaching that of SM/DOPC (0.5/0.5) mixtures. By further increasing the amount of cholesterol, the domains disappeared but the lipid mobility remained higher than that of the SM-rich domains (50 mol% cholesterol, Fig. 2B, short dash (b)), though lower than in SM/DOPC = 0.5/0.5 GUVs. Any further increase in cholesterol concentration made the whole membrane stiffer (e.g. 65 mol% cholesterol in Fig. 2B, short dash dot (c)). Taking different SM/PC molar ratios ≥ 1 (e.g. 0.53/0.13), the domain morphology and the lipid diffusion were unchanged (see Table I). On the other hand, in the case of SM/PC molar ratios < 1, no domains were visualized by confocal microscopy and the lipid dynamics measured was rather high and very close to that in pure DOPC (e.g. SM/DOPC 0.13/0.53, see Table I). For all of the FCS curves, excellent fits were produced with a one-component normal Brownian diffusion model (37Schwille P. Cell Biochem. Biophys. 2001; 34: 383-408Crossref PubMed Scopus (310) Google Scholar). The diffusion coefficients, calculated from the fitting of FCS curves shown in Fig. 2, are reported as a function of mol% of cholesterol in Fig. 3 (see also Table I).Table ITranslational diffusion coefficients for the ternary SM/DOPC/cholesterol systemComposition, molar fractionNo phase separationPhase separationSMDOPCCholDDldD lo,×10-8 cm2/s×10-8 cm2/s×10-8 cm2/s100immoble-0106.3 ± 0.2-0.50.502.6 ± 0.2-0.450.450.14.9 ± 0.30.105 ± 0.0310.40.40.25.15 ± 0.150.255 ± 0.0580.330.330.335.1 ± 0.40.795 ± 0.1080.250.250.51.6 ± 0.20.1750.1750.651.1 ± 0.10.10.80.14.9 ± 0.40.130.530.334.6 ± 0.40.530.130.335.1 ± 0.90.8 ± 0.1 Open table in a new tab Fig. 3Average diffusion coefficients, as determined from fitting the autocorrelation curves in Fig. 2, A and B, as a function of cholesterol concentration. Values for the DOPC-enriched phase are indicated by open circles, those for the SM-enriched phase and for mixtures that do not give rise to phase separation (within the optical resolution) are indicated by filled squares. The dashed line, which corresponds to the value of lipid diffusion coefficient in GUVs of DOPC, is shown as a reference.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Lipid Mobility in Binary Mixtures—In order to investigate in more detail the lipid spatial organization in raft-exhibiting membranes, lipid mobility in GUVs prepared from ternary mixtures of SM/DOPC/cholesterol was compared with that in GUVs from binary mixtures of DOPC/cholesterol, SM/cholesterol and DOPC/SM. For all of these binary compositions, GUVs showed no phase separation by confocal microscopy. The FCS measurements of DiI-C18 mobility could be well fitted with a one diffusion-component. In Fig. 4A, FCS curves recorded for DOPC/cholesterol membranes are shown. The diffusion coefficients obtained from the fitting are plotted as a function of cholesterol concentration in Fig. 4B: a gradual shift of lipid mobility toward lower values is observed upon increase of the amount of cholesterol. Compared with DOPC/cholesterol mixtures, the opposite effect of the cholesterol was observed in SM/cholesterol mixtures, where the lipid mobility increased upon increase of mol% of cholesterol (see FCS curves in Fig. 4C and the corresponding diffusion coefficients reported as a function of mol% of cholesterol in Fig. 4D). For binary mixtures of SM/DOPC, phase separation was observed by confocal microscopy for mol% of SM ≥ 80%. DiI-C18 favored the SM/DOPC gel-phase, with a partition coefficient of ∼ 3. In Fig. 4E the FCS curves and in Fig. 4F the corresponding diffusion coefficients of DiI-C18 are reported for GUVs composed of SM/DOPC at different ratios. For the data at 80 mol% SM, only FCS curves in the less bright fluid-disordered regions could be recorded, as the FCS measurements in the SM gel-phase were strongly affected by photobleaching. These latter results confirm that, in SM/DOPC membranes with ≥ 80 mol% of SM, an equilibrium is established at room temperature between a SM-enriched gel-phase and a SM/DOPC-containing, liquid-disordered phase characterized by high lipid mobility. Phase Diagram—The FCS measurements were used to build the phase diagram shown in Fig. 5. Starting from the left axis (DOPC/cholesterol), the membrane lipid mobility continuously decreases upon increase of cholesterol concentration. Consistent with previous findings for phospholipid/cholesterol mixtures (23Brown D.A. London E. J. Membr. Biol. 1998; 164: 103-114Crossref PubMed Scopus (850) Google Scholar, 47Silvius J.R. del Giudice D. Lafleur M. Biochemistry. 1996; 35: 15198-15208Crossref PubMed Scopus (196) Google Scholar), a transition from liquid-disordered to liquid-ordered phase can be identified around ∼40 mol% of cholesterol. As the lipid diffusion coefficients in DOPC-enriched domains of DOPC/SM/cholesterol GUVs almost match that of pure DOPC, we can conclude that the DOP