In the last decade there have been marked reductions in malaria incidence in sub-Saharan Africa. Sustaining these reductions will rely upon insecticides to control the mosquito malaria vectors. We report that in the primary African malaria vector, Anopheles gambiae sensu stricto, a single enzyme, CYP6M2, confers resistance to two classes of insecticide. This is unique evidence in a disease vector of cross-resistance associated with a single metabolic gene that simultaneously reduces the efficacy of two of the four classes of insecticide routinely used for malaria control. The gene-expression profile of a highly DDT-resistant population of A. gambiae s.s. from Ghana was characterized using a unique whole-genome microarray. A number of genes were significantly overexpressed compared with two susceptible West African colonies, including genes from metabolic families previously linked to insecticide resistance. One of the most significantly overexpressed probe groups (false-discovery rate-adjusted P < 0.0001) belonged to the cytochrome P450 gene CYP6M2. This gene is associated with pyrethroid resistance in wild A. gambiae s.s. populations) and can metabolize both type I and type II pyrethroids in recombinant protein assays. Using in vitro assays we show that recombinant CYP6M2 is also capable of metabolizing the organochlorine insecticide DDT in the presence of solubilizing factor sodium cholate.

Abstract Resistance to insecticides in Anopheles mosquitoes threatens the effectiveness of the most widespread tools currently used to control malaria. The genetic underpinnings of resistance are still only partially understood, with much of the variance in resistance phenotype left unexplained. We performed a multi-country large scale genome-wide association study of resistance to two insecticides widely used in malaria control: deltamethrin and pirimiphos-methyl. Using a bioassay methodology designed to maximise the phenotypic difference between resistant and susceptible samples, we sequenced 969 phenotyped female An. gambiae and An. coluzzii from ten locations across four countries in West Africa (Benin, Côte d’Ivoire, Ghana and Togo), identifying single nucleotide polymorphisms (SNPs) and copy number variants (CNVs) segregating in the populations. The patterns of resistance association were highly multiallelic and variable between populations, with different genomic regions contributing to resistance, as well as different mutations within a given region. While the strongest and most consistent association with deltamethrin resistance came from the region around Cyp6aa1 , this resistance was based on a combination of several independent CNVs in An. coluzzii , and on a non-CNV bearing haplotype in An. gambiae . Further signals involved a range of cytochrome P450, mitochondrial, and immunity genes. Similarly, for pirimiphos-methyl, while the strongest signal came from the region of Ace1 , more widespread signals included cytochrome P450s, glutathione S-transferases, and a subunit of the nAChR target site of neonicotinoid insecticides. The regions around Cyp9k1 and the Tep family of immune genes were associated with resistance to both insecticide classes, suggesting possible cross-resistance mechanisms. These locally-varying, multigenic and multiallelic patterns highlight the challenges involved in genomic monitoring and surveillance of resistance, and form the basis for improvement of methods used to detect and predict resistance. Based on simulations of resistance variants, we recommend that yet larger scale studies, exceeding 500 phenotyped samples per population, are required to better identify associated genomic regions.

Abstract Vector population control using insecticides is a key element of current strategies to prevent malaria transmission in Africa. The introduction of effective insecticides, such as the organophosphate pirimiphos-methyl, is essential to overcome the recurrent emergence of resistance driven by the highly diverse Anopheles genomes. Here, we use a population genomic approach to investigate the basis of pirimiphos-methyl resistance in the major malaria vectors Anopheles gambiae and A. coluzzii . A combination of copy number variation and a single non-synonymous substitution in the acetylcholinesterase gene, Ace1 , provides the key resistance diagnostic in an A. coluzzii population from Côte d’Ivoire that we used for sequence-based association mapping, with replication in other West African populations. The Ace1 and substitution and duplications occur on a unique resistance haplotype that evolved in A. gambiae and introgressed into A. coluzzii , and is now common in West Africa probably due to cross-resistance with previously used insecticides. Our findings highlight the phenotypic value of this complex resistance haplotype and clarify its evolutionary history, providing tools to understand the current and future effectiveness of pirimiphos-methyl based interventions.

The primary control methods for the African malaria mosquito, Anopheles gambiae, are based on insecticidal interventions. Emerging resistance to these compounds is therefore of major concern to malaria control programs. The organophosphate (OP), pirimiphos-methyl, is a relatively new chemical in the vector control armory but is now widely used in indoor-residual spray campaigns. While generally effective, phenotypic resistance has developed in some areas in malaria vectors. Here, we used a population genomic approach to identify novel mechanisms of resistance to pirimiphos-methyl in A. gambiae s.l mosquitoes. In multiple populations, we found large and repeated signals of selection at a locus containing a cluster of detoxification enzymes, some of whose orthologs are known to confer resistance to OPs in Culex pipiens. Close examination revealed a pair of alpha-esterases, Coeae1f and Coeae2f, and a complex and diverse pattern of haplotypes under selection in A. gambiae, A. coluzzii and A. arabiensis. As in C. pipiens, copy number variants have arisen at this locus. We used diplotype clustering to examine whether these signals arise from parallel evolution or adaptive introgression. Using whole-genome sequenced phenotyped samples, we found that in West Africa, a copy number variant in A. gambiae is associated with resistance to pirimiphos-methyl. Overall, we demonstrate a striking example of contemporary parallel evolution which has important implications for malaria control programs.

Abstract The primary control methods for the African malaria mosquito, Anopheles gambiae , are based on insecticidal interventions. Emerging resistance to these compounds is therefore of major concern to malaria control programmes. The organophosphate, pirimiphos-methyl, is a relatively new chemical in the vector control armoury but is now widely used in indoor residual spray campaigns. Whilst generally effective, phenotypic resistance has developed in some areas in malaria vectors. Here, we used a population genomic approach to identify novel mechanisms of resistance to pirimiphos-methyl in Anopheles gambiae s . l mosquitoes. In multiple populations, we found large and repeated signals of selection at a locus containing a cluster of detoxification enzymes, some of whose orthologs are known to confer resistance to organophosphates in Culex pipiens . Close examination revealed a pair of alpha-esterases, Coeae1f and Coeae2f , and a complex and diverse pattern of haplotypes under selection in An. gambiae, An. coluzzii and An. arabiensis . As in Cx. pipiens , copy number variation seems to play a role in the evolution of insecticide resistance at this locus. We used diplotype clustering to examine whether these signals arise from parallel evolution or adaptive introgression. Using whole-genome sequenced phenotyped samples, we found that in West Africa, a copy number variant in Anopheles gambiae is associated with resistance to pirimiphos-methyl. Overall, we demonstrate a striking example of contemporary parallel evolution which has important implications for malaria control programmes.

To keep ahead of the evolution of resistance to insecticides in mosquitoes, national malaria control programmes must make use of a range of insecticides, both old and new, while monitoring resistance mechanisms. The outdoor-biting malaria vector Anopheles arabiensis is of increasing concern for malaria transmission because it is apparently less susceptible to many indoor control interventions, yet knowledge of its mechanisms of resistance remains limited. Furthermore, comparatively little is known in general about resistance to non-pyrethroid insecticides such as pirimiphos-methyl (PM), which are crucial for effective control in the context of globally high resistance to pyrethroids. We performed a genome-wide association study to determine the molecular mechanisms of resistance to the pyrethroid deltamethrin (commonly used in bednets) and PM (widespread use for indoor spraying), in An . arabiensis from 2 regions in Tanzania. Genomic regions of positive selection in these populations were largely driven by copy number variants (CNVs) in gene families involved in metabolic resistance. We found evidence of a new gene cluster involved in resistance to PM, identifying a strong selective sweep tied to a CNV in the carboxylesterase genes Coeae2g - Coeae6g . Using complementary data from another malaria vector, An . coluzzii , in Ghana, we show that copy number at this locus is significantly associated with PM resistance. Similarly, for deltamethrin, resistance was strongly associated with a novel CNV allele in the Cyp6aa / Cyp6p cluster ( Cyp6aap _Dup33). Against this background of metabolic resistance, resistance caused by mutations in the insecticide target sites was very rare or absent. Mutations in the pyrethroid target site Vgsc were at very low frequency in Tanzania, yet combining these samples with 3 An . arabiensis individuals from West Africa revealed a startling evolutionary diversity, with up to 5 independent origins of Vgsc -995 mutations found within just 8 haplotypes. Thus, despite having been first recorded over 10 years ago, Vgsc resistance mutations in Tanzanian An . arabiensis have remained at stable low frequencies. Overall, our results provide a new copy number marker for monitoring resistance to PM in malaria mosquitoes, and reveal the complex picture of resistance patterns in An . arabiensis .

Introduction Malaria and sickle cell disease (SCD) co-morbidity have previously been reported in Ghana. However, there is paucity of data on haematological profiles and oxidative stress in co-morbidity states. This study identified novel inflammatory biomarkers associated with malaria in SCD and analyzed the levels of 8-iso-prostaglandin F2α oxidative stress biomarker in malaria-SCD co-morbidity in Ghanaian patients. Methods Blood (5ml) was collected from malaria patients into K3-EDTA tube. Malaria parasites speciation and quantification were then done according WHO guidelines. All eligible samples were assayed for haematological profile, sickle cell phenotyping, infectious markers (hepatitis B, hepatitis C, syphilis and HIV 1&2) and plasma levels of 8-epi-prostaglandin F2α. . Results Prevalence of malaria in SCD (malaria-SCD) was 13.4% (45/335). Male: female ratio was 0.8:1 (X2=1.43, p=0.231). Mean ages for malaria in normal haemoglobin type (malaria-HbAA) and malaria-SCD were 12.79±4.91 and 11.56±3.65 years respectively (p=0.048). Geometric mean of parasite density was higher in malaria-HbAA (20394 parasites/µl vs. 9990 parasites/µl, p=0.001) whilst mean body temperature was higher in malaria-SCD (39.0±0.87°C vs. 37.9±1.15°C, p=0.001). Mean leukocytes, lymphocytes, eosinophils, monocytes, platelets and platelet indices values were significantly elevated in malaria-SCD. Significant reduction in RBC and RBC indices in malaria-SCD were also observed. Eosinophils-to-basophils ratio (EBR) and monocytes-to-basophils ratio (MBR) were novel cellular inflammatory biomarkers which could predict malaria in SCD. The sensitivities of cut-off values of EBR>14, MBR>22 and combined use of EBR>14 and MBR>22 were 79.55%, 84.09% and 91.11% respectively. Mean 8-iso-prostaglandin F2α was 338.1pg/ml in malaria-HbAA and 643.8pg/ml in malaria-SCD (p=0.001). 8-iso-prostaglandin F2α correlated with parasite density (r=0.787, p=0.001), temperature (r=0.566, p=0.001) and leucocytes (r=0.573, p=0.001) and negatively correlated with RBC (r=-0.476, p=0.003), haemoglobin (r=-0.851, p=0.001) and haematocrit (r=-0.735, p=0.001). Conclusion

Vector-borne disease control relies on efficient vector surveillance, mostly carried out using traps whose number and locations are often determined by expert opinion rather than a rigorous quantitative sampling design. In this work we first propose a framework for ecological sampling design which in its preliminary stages can take into account environmental conditions obtained from open data (i.e. remote sensing and meteorological stations). These environmental data are used to delimit the area into ecologically homogenous strata. By employing a model-based sampling design, the traps are deployed among the strata using a mixture of random and grid locations which allows balancing predictions and fitting accuracies. Sample sizes and the effect of ecological strata on sample sizes are estimated from previous sampling campaigns. Notably, we found that a configuration of 30 locations with 4 households each (120 traps) will have a similar accuracy in the estimates of mosquito abundance as 300 random samples. In addition, we show that random sampling independently from ecological strata, produces biased estimates of the mosquito abundance. Finally, we propose standardizing reporting of sampling designs to allow transparency and repetition / re-use in subsequent sampling campaigns.

Abstract To keep ahead of the evolution of resistance to insecticides in mosquitoes, national malaria control programmes must make use of a range of insecticides, both old and new, while monitoring resistance mechanisms. Knowledge of the mechanisms of resistance remains limited in Anopheles arabiensis , which in many parts of Africa is of increasing importance because it is apparently less susceptible to many indoor control interventions. Furthermore, comparatively little is known in general about resistance to non-pyrethroid insecticides such as pirimiphos-methyl (PM), which are crucial for effective control in the context of resistance to pyrethroids. We performed a genome-wide association study to determine the molecular mechanisms of resistance to deltamethrin (commonly used in bednets) and PM, in An. arabiensis from two regions in Tanzania. Genomic regions of positive selection in these populations were largely driven by copy number variants (CNVs) in gene families involved in resistance to these two insecticides. We found evidence of a new gene cluster involved in resistance to PM, identifying a strong selective sweep tied to a CNV in the Coeae2g-Coeae6g cluster of carboxylesterase genes. Using complementary data from An. coluzzii in Ghana, we show that copy number at this locus is significantly associated with PM resistance. Similarly, for deltamethrin, resistance was strongly associated with a novel CNV allele in the Cyp6aa / Cyp6p cluster. Against this background of metabolic resistance, target site resistance was very rare or absent for both insecticides. Mutations in the pyrethroid target site Vgsc were at very low frequency in Tanzania, yet combining these samples with three An. arabiensis individuals from West Africa revealed a startling diversity of evolutionary origins of target site resistance, with up to 5 independent origins of Vgsc -995 mutations found within just 8 haplotypes. Thus, despite having been first recorded over 10 years ago, Vgsc resistance mutations in Tanzanian An. arabiensis have remained at stable low frequencies. Overall, our results provide a new copy number marker for monitoring resistance to PM in malaria mosquitoes, and reveal the complex picture of resistance patterns in An. arabiensis .

Resistance to insecticides and adaptation to a diverse range of environments present challenges to Anopheles gambiae s.l. mosquito control efforts in sub-Saharan Africa. Whole-genome-sequencing is often employed for identifying the genomic basis underlying adaptation in Anopheles, but remains expensive for large-scale surveys. Low-coverage whole-genome-sequencing (lcWGS) can identify regions of the genome involved in adaptation at a lower cost, but is currently untested in Anopheles mosquitoes. Here, we use lcWGS to investigate population genetic structure and identify signatures of local adaptation in Anopheles mosquitoes across southern Ghana. In contrast to previous analyses, we find no structuring by ecoregion, with Anopheles coluzzii and Anopheles gambiae populations largely displaying the hallmarks of large, unstructured populations. However, we find signatures of selection at insecticide resistance (IR) loci that appear ubiquitous across ecoregions in An. coluzzii, and strongest in forest ecoregions in An. gambiae. In the IR gene Cyp9k1, we find species-specific alleles under selection, suggesting interspecific variation in the precise mechanism of resistance conferred by Cyp9k1. Our study highlights resistance candidate genes in this region, and validates lcWGS, potentially to very low coverage levels, for population genomics and exploratory surveys for adaptation in Anopheles taxa.