Cristae membrane state plays a central role in regulating mitochondrial function and cellular metabolism. The protein Optic atrophy 1 (Opa1) is an important crista remodeler that exists as two forms in the mitochondrion, a membrane-anchored long form (l-Opa1) and a processed short form (s-Opa1). The mechanisms for how Opa1 influences cristae shape have remained unclear due to lack of native three-dimensional views of cristae. We perform in situ cryo-electron tomography of cryo-focused ion beam milled mouse embryonic fibroblasts with defined Opa1 states to understand how each form of Opa1 influences cristae architecture. In our tomograms, we observe a variety of cristae shapes with distinct trends dependent on s-Opa1:l-Opa1 balance. Increased l-Opa1 levels promote cristae stacking and elongated mitochondria while increased s-Opa1 levels correlated with irregular cristae packing and round mitochondria shape. Functional assays indicate a role for l-Opa1 in wild-type apoptotic and calcium handling responses, and compromised respiratory function under Opa1 imbalance. In summary, we provide three-dimensional visualization of cristae architecture to reveal relationships between mitochondrial ultrastructure and cellular function dependent on Opa1-mediated membrane remodeling.

Abstract The bacterial division apparatus builds daughter cell poles by catalyzing the synthesis and remodeling of the septal peptidoglycan (sPG) cell wall. Understanding of this essential process has been limited by the lack of native three-dimensional visualization of developing septa. Here, we used state-of-the-art cryogenic electron tomography (cryo-ET) and fluorescence microscopy to understand the division site architecture and sPG biogenesis dynamics of the Gram-negative bacterium Escherichia coli . Our results with mutant cells altered in the regulation of sPG biogenesis revealed a striking and unexpected similarity between the architecture of E. coli septa with those from Gram-positive bacteria, suggesting a conserved morphogenic mechanism. Furthermore, we found that the cell elongation and division machineries are in competition and that their relative activities determine the shape of cell constrictions and the poles they form. Overall, our results highlight how the activity of the division system can be modulated to generate the diverse array of morphologies observed in the bacterial domain. Highlights The division site architecture of E. coli can be modulated to resemble that of diverse bacteria. Cell wall degradation at the division site activates septal cell wall synthesis. Assembly of the cytoskeletal ring at the division site is modulated by cell wall remodeling. Balance between the activities of the elongation and division systems modulates cell shape.

Prominin-1 (Prom1) is a pentaspan membrane protein that associates with curved regions of the plasma membrane. Prom1 localizes to cholesterol-rich domains and requires membrane cholesterol to support membrane remodeling. Membrane bending activity is particularly evident in photoreceptors, where Prom1 mutations cause loss of outer segment disk homeostasis leading to cone-rod retinal dystrophy (CCRD). However, the mechanistic link between prominin-dependent cholesterol binding, membrane remodeling, and retinal disease remains unclear. Here, we characterize the membrane bending function and specific cholesterol binding activity of Prom1 and its proposed homolog Tweety homology 1 (Ttyh1) in extracellular vesicles (EVs). Prom1 and Ttyh1 induce formation of EVs in cultured mammalian cells that are biophysically similar. Though both proteins bend membranes and form EVs at the plasma membrane, Ttyh1 lacks a stable interaction with cholesterol that is present in Prom1. Correspondingly, Ttyh1 forms EVs that are more deformed than those produced by Prom1. An evolutionarily conserved and retinal disease-associated Prom1 residue (Trp-795) is necessary for cholesterol binding, EV membrane deformation, and efficient trafficking to the plasma membrane. Removal of N-glycan moieties from Prom1 biases the enzyme toward a cholesterol-bound state. We propose that Prom1 and Ttyh1 are both members of a single prominin family of membrane bending proteins, that Ttyh1 is a constitutively active member of this family, and that Prom1 is regulated by cholesterol binding and N-glycosylation. These findings shed light on mechanisms of prominin family function in disease and help unify models of prominin function across diverse cell types.