ABSTRACT Biofilms are a protected niche for microorganisms, where they are safe from antibiotic treatment and can create a source of persistent infection. Using two clinically relevant Candida albicans biofilm models formed on bioprosthetic materials, we demonstrated that biofilm formation proceeds through three distinct developmental phases. These growth phases transform adherent blastospores to well-defined cellular communities encased in a polysaccharide matrix. Fluorescence and confocal scanning laser microscopy revealed that C. albicans biofilms have a highly heterogeneous architecture composed of cellular and noncellular elements. In both models, antifungal resistance of biofilm-grown cells increased in conjunction with biofilm formation. The expression of agglutinin-like ( ALS ) genes, which encode a family of proteins implicated in adhesion to host surfaces, was differentially regulated between planktonic and biofilm-grown cells. The ability of C. albicans to form biofilms contrasts sharply with that of Saccharomyces cerevisiae , which adhered to bioprosthetic surfaces but failed to form a mature biofilm. The studies described here form the basis for investigations into the molecular mechanisms of Candida biofilm biology and antifungal resistance and provide the means to design novel therapies for biofilm-based infections.

The oral microbiome–organisms residing in the oral cavity and their collective genome–are critical components of health and disease. The fungal component of the oral microbiota has not been characterized. In this study, we used a novel multitag pyrosequencing approach to characterize fungi present in the oral cavity of 20 healthy individuals, using the pan-fungal internal transcribed spacer (ITS) primers. Our results revealed the “basal” oral mycobiome profile of the enrolled individuals, and showed that across all the samples studied, the oral cavity contained 74 culturable and 11 non-culturable fungal genera. Among these genera, 39 were present in only one person, 16 genera were present in two participants, and 5 genera were present in three people, while 15 genera (including non-culturable organisms) were present in ≥4 (20%) participants. Candida species were the most frequent (isolated from 75% of participants), followed by Cladosporium (65%), Aureobasidium, Saccharomycetales (50% for both), Aspergillus (35%), Fusarium (30%), and Cryptococcus (20%). Four of these predominant genera are known to be pathogenic in humans. The low-abundance genera may represent environmental fungi present in the oral cavity and could simply be spores inhaled from the air or material ingested with food. Among the culturable genera, 61 were represented by one species each, while 13 genera comprised between 2 and 6 different species; the total number of species identified were 101. The number of species in the oral cavity of each individual ranged between 9 and 23. Principal component (PCO) analysis of the obtained data set followed by sample clustering and UniFrac analysis revealed that White males and Asian males clustered differently from each other, whereas both Asian and White females clustered together. This is the first study that identified the “basal mycobiome” of healthy individuals, and provides the basis for a detailed characterization of the oral mycobiome in health and disease.

Biofilms, likely the predominant mode of device-related microbial infection, exhibit resistance to antimicrobial agents. Evidence suggests that Candida biofilms have dramatically reduced susceptibility to antifungal drugs. We examined antifungal susceptibilities of Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms grown on a bioprosthetic model. In addition to conventional agents, we determined if new antifungal agents (triazoles, amphotericin B lipid formulations, and echinocandins) have activities against Candida biofilms. We also explored effects of preincubation of C. albicans cells with subinhibitory concentrations (sub-MICs) of drugs to see if they could modify subsequent biofilm formation. Finally, we used confocal scanning laser microscopy (CSLM) to image planktonic- and biofilm-exposed blastospores to examine drug effects on cell structure. Candida biofilms were formed on silicone elastomer and quantified by tetrazolium and dry weight (DW) assays. Susceptibility testing of fluconazole, nystatin, chlorhexidine, terbenafine, amphotericin B (AMB), and the triazoles voriconazole (VRC) and ravuconazole revealed resistance in all Candida isolates examined when grown as biofilms, compared to planktonic forms. In contrast, lipid formulations of AMB (liposomal AMB and AMB lipid complex [ABLC]) and echinocandins (caspofungin [Casp] and micafungin) showed activity against Candida biofilms. Preincubation of C. albicans cells with sub-MIC levels of antifungals decreased the ability of cells to subsequently form biofilm (measured by DW; P < 0.0005). CSLM analysis of planktonic and biofilm-associated blastospores showed treatment with VRC, Casp, and ABLC resulted in morphological alterations, which differed with each agent. In conclusion, our data show that Candida biofilms show unique susceptibilities to echinocandins and AMB lipid formulations.

Denture biofilms represent a protective reservoir for oral microbes. The study of the biology of Candida in these biofilms requires a reliable model. A reproducible model of C. albicans denture biofilm was developed and used to determine the susceptibility of two clinically relevant C. albicans isolates against 4 antifungals. C. albicans, growing as a biofilm, exhibited resistance to amphotericin B, nystatin, chlorhexidine, and fluconazole, with 50% reduction in metabolic activity (50% RMA) at concentrations of 8, 16, 128, and > 64 μg/mL, respectively. In contrast, planktonically cultured C. albicans were susceptible (50% RMA for the same antifungals was obtained at 0.25, 1.0, 4.0, and 0.5 μg/mL, respectively). In conclusion, results obtained by means of our biofilm model show that biofilm-associated C. albicans cells, compared with cells grown in planktonic form, are resistant to antifungals used to treat denture stomatitis.

Background: Onychomycosis, a fungal infection of the nail bed, is responsible for up to 50% of nail disorders. Although several surveys have been conducted in different parts of the world, there have been no multicenter epidemiologic surveys of onychomycosis in North America. Objective: A 12-center study was undertaken to (1) determine the frequency of onychomycosis, (2) identify organisms recovered from the nails, and (3) determine the antifungal susceptibility of isolates. Methods: A total of 1832 subjects participated in this study and completed a comprehensive questionnaire, and nail clippings were collected for potassium hydroxide examination and culturing. Results: The frequency of onychomycosis, as defined by the presence of septate hyphae on direct microscopy and/or the recovery of a dermatophyte, was found to be 13.8%. In general, the dermatophyte isolates were susceptible to the antifungals tested. Conclusion: Because of the limited number of large-scale studies, the baseline incidence is not firmly established. However, the higher frequency of onychomycosis in this study may confirm the suspected increase in incidence of disease in North America. (J Am Acad Dermatol 2000;43:641-8.).

Candida albicans biofilms are formed through three distinct developmental phases and are associated with high fluconazole (FLU) resistance. In the present study, we used a set of isogenic Candida strains lacking one or more of the drug efflux pumps Cdr1p, Cdr2p, and Mdr1p to determine their role in FLU resistance of biofilms. Additionally, variation in sterol profile as a possible mechanism of drug resistance was investigated. Our results indicate that parent and mutant strains formed similar biofilms. However, biofilms formed by double and triple mutants were more susceptible to FLU at 6 h (MIC = 64 and 16 microg/ml, respectively) than the wild-type strain (MIC > 256 microg/ml). At later time points (12 and 48 h), all the strains became resistant to this azole (MIC > or = 256 microg/ml), indicating lack of involvement of efflux pumps in resistance at late stages of biofilm formation. Northern blot analyses revealed that Candida biofilms expressed CDR and MDR1 genes in all the developmental phases, while planktonic cells expressed these genes only at the 12- and 48-h time points. Functionality of efflux pumps was assayed by rhodamine (Rh123) efflux assays, which revealed significant differences in Rh123 retention between biofilm and planktonic cells at the early phase (P = 0.0006) but not at later stages (12 and 48 h). Sterol analyses showed that ergosterol levels were significantly decreased (P < 0.001) at intermediate and mature phases, compared to those in early-phase biofilms. These studies suggest that multicomponent, phase-specific mechanisms are operative in antifungal resistance of fungal biofilms.

ABSTRACT Little is known about fungal biofilms, which may cause infection and antibiotic resistance. In this study, biofilm formation by different Candida species, particularly Candida albicans and C . parapsilosis , was evaluated by using a clinically relevant model of Candida biofilm on medical devices. Candida biofilms were allowed to form on silicone elastomer and were quantified by tetrazolium (XTT) and dry weight (DW) assays. Formed biofilm was visualized by using fluorescence microscopy and confocal scanning laser microscopy with Calcofluor White (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), concanavalin A-Alexafluor 488 (Molecular Probes, Eugene, Oreg.), and FUN-1 (Molecular Probes) dyes. Although minimal variations in biofilm production among invasive C . albicans isolates were seen, significant differences between invasive and noninvasive isolates ( P < 0.001) were noted. C . albicans isolates produced more biofilm than C . parapsilosis , C . glabrata , and C . tropicalis isolates, as determined by DW assays ( P was <0.001 for all comparisons) and microscopy. Interestingly, noninvasive isolates demonstrated a higher level of XTT activity than invasive isolates. On microscopy, C . albicans biofilms had a morphology different from that of other species, consisting of a basal blastospore layer with a dense overlying matrix composed of exopolysaccharides and hyphae. In contrast, C . parapsilosis biofilms had less volume than C . albicans biofilms and were comprised exclusively of clumped blastospores. Unlike planktonically grown cells, Candida biofilms rapidly (within 6 h) developed fluconazole resistance (MIC, >128 μg/ml). Importantly, XTT and FUN-1 activity showed biofilm cells to be metabolically active. In conclusion, our data show that C . albicans produces quantitatively larger and qualitatively more complex biofilms than other species, in particular, C . parapsilosis .

Crohn's disease (CD) results from a complex interplay between host genetic factors and endogenous microbial communities. In the current study, we used Ion Torrent sequencing to characterize the gut bacterial microbiota (bacteriome) and fungal community (mycobiome) in patients with CD and their nondiseased first-degree relatives (NCDR) in 9 familial clusters living in northern France-Belgium and in healthy individuals from 4 families living in the same area (non-CD unrelated [NCDU]). Principal component, diversity, and abundance analyses were conducted, and CD-associated inter- and intrakingdom microbial correlations were determined. Significant microbial interactions were identified and validated using single- and mixed-species biofilms. CD and NCDR groups clustered together in the mycobiome but not in the bacteriome. Microbiotas of familial (CD and NCDR) samples were distinct from those of nonfamilial (NCDU) samples. The abundance of Serratia marcescens and Escherichia coli was elevated in CD patients, while that of beneficial bacteria was decreased. The abundance of the fungus Candida tropicalis was significantly higher in CD than in NCDR (P = 0.003) samples and positively correlated with levels of anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA). The abundance of C. tropicalis was positively correlated with S. marcescens and E. coli, suggesting that these organisms interact in the gut. The mass and thickness of triple-species (C. tropicalis plus S. marcescens plus E. coli) biofilm were significantly greater than those of single- and double-species biofilms. C. tropicalis biofilms comprised blastospores, while double- and triple-species biofilms were enriched in hyphae. S. marcescens used fimbriae to coaggregate or attach with C. tropicalis/E. coli, while E. coli was closely apposed with C. tropicalis Specific interkingdom microbial interactions may be key determinants in CD.Here, we characterized the gut bacterial microbiota (bacteriome) and fungal community (mycobiome) in multiplex families with CD and healthy relatives and defined the microbial interactions leading to dysbiosis in CD. We identified fungal (Candida tropicalis) and bacterial (Serratia marcescens and Escherichia coli) species that are associated with CD dysbiosis. Additionally, we found that the level of anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA; a known CD biomarker) was associated with the abundance of C. tropicalis We also identified positive interkingdom correlations between C. tropicalis, E. coli, and S. marcescens in CD patients and validated these correlations using in vitro biofilms. These results provide insight into the roles of bacteria and fungi in CD and may lead to the development of novel treatment approaches and diagnostic assays.

Abstract Treatment with neoadjuvant chemotherapy (NAC) in muscle invasive bladder cancer (MIBC) is associated with clinical benefit in urothelial carcinoma. While extensive research evaluating role of tumor mutational expression profiles and clinicopathologic factors into chemoresponse has been published, the role of gut microbiome (GM) in bladder cancer in chemoresponse has not been thoroughly evaluated. A working knowledge of the microbiome and its effect on all forms of cancer therapy in BC is critical. Here we examine gut microbiome of bladder cancer patients undergoing NAC. Overall, there was no significant difference in alpha and beta diversity by responder status. However, analysis of fecal microbiome samples showed that a higher abundance of Bacteroides within both institutional cohorts during NAC was associated with residual disease at the time of radical cystectomy regardless of chemotherapy regimen. Group community analysis revealed presence of favorable microbial subtypes in complete responders. Finally, fecal microbial composition outperformed clinical variables in prediction of complete response (AUC 0.88 vs AUC 0.50), however, no single microbial species could be regarded as a fully consistent biomarker. Microbiome-based community signature as compared to single microbial species is more likely to be associated as the link between bacterial composition and NAC response.

Central line associated bloodstream infections (CLABSIs) are increasingly recognized to be associated with intralumenal microbial biofilms, and effective measures for the prevention and treatment of BSI remain lacking. This report evaluates a new commercially developed antimicrobial catheter lock solution (ACL) containing trimethoprim (5 mg/ml) and ethanol (25%) and CA-EDTA 3% for activity against bacterial and fungal biofilms using in vitro and in vivo (rabbit) catheter biofilm models. Biofilms were formed with bacterial (seven different species including vancomycin-resistant enterococcus, VRE) or fungal (C. albicans) species on catheter materials. Biofilm formation was evaluated by quantitative culture (colony forming units, CFUs) and scanning electron microscopy (SEM). Treatment with ACL inhibited growth of adhesion phase biofilms in vitro after 60 min (VRE) or 15 min (all others), while mature biofilms were eradicated after exposure for 2 or 4 h, compared to control. Similar results were observed for drug-resistant bacteria. In the catheterized rabbit model, when compared against heparinized saline control, ACL lock therapy significantly reduced the catheter bacterial (3.49 ± 0.75 vs. 0.03 ± 0.06 log CFU/catheter, respectively; P = 0.001) and fungal burden (2.48 ± 1.60 vs. 0.55 ± 1.19 log CFU/catheter segment, respectively; P = 0.012). SEM also demonstrated eradication of bacterial and fungal biofilms in vivo on catheters exposed to ACL, while vigorous biofilms were observed on untreated control catheters. Our results demonstrate that ACL was efficacious against both adhesion phase and mature biofilms formed by bacteria and fungi in vitro as well as in vivo.