Abstract Many ion channels are multi-subunit complexes with a polar permeation pathway at the oligomeric interface, but their mechanisms of assembly into functional, thermodynamically stable units within the membrane are largely unknown. Here we characterize the assembly of the inverted-topology, homodimeric fluoride channel Fluc, leveraging a known mutation, N43S, that weakens Na + binding to the dimer interface, thereby unlocking the complex. While single-channel recordings show Na + is required for activation, single-molecule photobleaching and bulk Förster Resonance Energy Transfer experiments in lipid bilayers demonstrate that N43S Fluc monomers and dimers exist in dynamic equilibrium, even without Na + . Molecular dynamics simulations indicate this equilibrium is dominated by a differential in the lipid-solvation energetics of monomer and dimer, which stems from hydrophobic exposure of the polar ion pathway in the monomer. These results suggest a model wherein membrane-associated forces induce channel assembly while subsequent factors, in this case Na + binding, result in channel activation. Teaser Membrane morphology energetics foster inverted-topology Fluc channels to form dimers, which then become active upon Na + binding.

Abstract Membrane proteins are often structured as higher-order oligomers. Yet, the role of these specific assemblies is not always apparent, raising the question of whether differential oligomerization states can be linked to modulation of function. To better understand this hypothetical regulatory mechanism, there is an ongoing effort to quantify equilibrium reactions of membrane proteins in membranes. Single-molecule photobleaching analysis is particularly useful for this as it provides a binary readout of fluorophores attached to protein subunits at dilute conditions. The subunit capture method adds consideration of the Poisson probability of protein partitioning into liposomes from large equilibrium membranes. If the liposome size distribution is known, then the capture statistics can be modeled with accuracy to quantify oligomerization as a function of membrane density to obtain binding isotherms, as was demonstrated for the dimeric chloride/proton antiporter CLC-ec1. However, any quantification of stoichiometry also critically requires knowing the probability that a subunit is fluorescently labeled. Since labeling uncertainty is often unavoidable, we tested an alternate approach to estimate labeling yields using the photobleaching probability of an intrinsic dimeric control, the disulfide cross-linked R230C/L249C CLC-ec1. By iterative fitting of the experimental dimeric photobleaching probability distribution to a dimer model while varying labeling parameters, we predict the labeling yields measured by direct absorbance measurements of the purified protein before reconstitution. Finally, the average predicted labeling yield over multiple samples is used to estimate the dissociation constant of CLC-ec1 dimerization reactions, eliminating the need to quantify fluorophore labeling a priori . This approach can be generalized to study dimerization reactions where an irreversible dimeric control can be prepared. Thus, our study maps out a new method for quantifying fluorophore occupancy in samples that cannot be purified directly and improves quantification of membrane protein stoichiometry in membranes.

Familial dilated cardiomyopathy (DCM) is a leading cause of sudden cardiac death and a major indicator for heart transplant. The disease is frequently caused by mutations of sarcomeric proteins; however, it is not well understood how these molecular mutations lead to alterations in cellular organization and contractility. To address this critical gap in our knowledge, we studied the molecular and cellular consequences of a DCM mutation in troponin-T, ΔK210. We determined the molecular mechanism of ΔK210 and used computational modeling to predict that the mutation should reduce the force per sarcomere. In mutant cardiomyocytes, we found that ΔK210 not only reduces contractility, but also causes cellular hypertrophy and impairs cardiomyocytes ability to adapt to changes in substrate stiffness (e.g., heart tissue fibrosis that occurs with aging and disease). These results link the molecular and cellular phenotypes and implicate alterations in mechanosensing as an important factor in the development of DCM.