Abstract The assignment of blood-based biomarkers for neurodegenerative diseases is of great clinical value. Well-developed and validated blood-based biomarkers can serve in early diagnosis and prognosis as well as aid in patient screening when recruiting for clinical trials. We attempted to establish a portfolio for post-translationally modified TAR DNA/RNA-binding protein (TDP-43), a regulator of nuclear transcription, in platelet cytosol obtained from patients with Alzheimer’s disease (AD) comparing to age-matched healthy subjects and a disease control cohort. We aimed to identify the most prominent post-translational modifications of TDP-43 as an AD-relevant biomarker and to demonstrate that such an assessment can be performed in peripheral blood. We have isolated TDP-43 protein from human platelet cytosol utilizing an Immunoaffinity chromatography. The eluates were immunoprobed with a series of antibodies raised against post-translationally modified proteins. We employed a capillary electrophoretic immunoassay (CEI) to assess the phosphorylated TDP-43 profile. We observed that SUMOylation, phosphorylation, ubiquitination, and cysteine oxidation of TDP-43 are more prominent in platelet cytosol of AD patients as compared to control subjects. These studies will pave the way for identifying disease-specific TDP-43 derivatives that can be potential biomarkers for early diagnosis and the development of therapeutics.

The material properties of tissues and their mechanical state is an important factor during development, disease, regenerative medicine and tissue engineering. Here we describe a microrheological measurement technique utilizing aggregates of microinjected ferromagnetic nickel particles to probe the viscoelastic properties of embryonic tissues. Quail embryos were cultured in a plastic incubator chamber located at the center of two pairs of crossed electromagnets. We estimate the Young's modulus of the ECM-rich region separating the mesoderm and endoderm in Hamburger Hamilton stage 6-10 quail embryos as 300 ± 100 Pa. We found a pronounced viscoelastic behavior consistent with a Zener (standard generalized solid) model. The viscoelastic response is about 45% of the total response, with a characteristic relaxation time of 1.3 sec.

Clefts of the lip and/or palate (CL/P) are common anomalies that occur in 1/800 live births. Pathogenic SPECC1L variants identified in patients with rare atypical clefts and syndromic CL/P suggest the gene plays a primary role in face and palate development. We have generated Specc1l gene-trap ( Specc1lcGT ) and truncation ( Specc1lΔC510 ) alleles that cause embryonic or perinatal lethality, respectively. Specc1lcGT/ΔC510 compound mutants show delayed and abnormal palatal shelf elevation at E14.5. By E15.5, the mutant shelves do elevate and fuse, however, the palatal rugae form abnormally. Palatogenesis requires extensive mesenchymal remodeling, especially during palatal shelf elevation. We posit that this remodeling involves collective movement of neural crest-derived palatal mesenchyme cells. Live time-lapse microscopy was performed to visualize in vitro wound-repair assays with wildtype and SPECC1L-deficient primary mouse embryonic palatal mesenchyme (MEPM) cells. SPECC1L-deficient MEPM cells consistently showed delayed closure in wound-repair assays. To evaluate which features of cellular movement were responsible, we performed automated particle image velocimetry (PIV) and manual cell tracking. The analyses revealed that both cell speed and directionality are disrupted in SPECC1L-deficient cells compared to controls. To determine if primary MEPM cells can move collectively, we assayed stream formation, which is a hallmark of collective movement. Indeed, MEPM cultures displayed correlated movement of neighboring cells. Importantly, correlation length was reduced in SPECC1L-deficient cultures, consistent with a role for SPECC1L in collective migration. Furthermore, we demonstrated that activation of the PI3K-AKT pathway with the 740Y-P small molecule can rescue the wound-closure delay in SPECC1L-deficient MEPM cells. Cell tracking analyses showed that this rescue was due to both increased speed and improved directionality. Altogether, our data showed a novel role for SPECC1L in guided movement through modulation of PI3K-AKT signaling.

ABSTRACT Measuring the mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile from previously frozen heart tissue samples from offspring born to an exercised sow provided descriptive data about exercise-induced mitochondrial biochemical changes in heart tissue from the offspring born to the exercised sow. The hypothesis proposed and tested was that a regular maternal exercise of a sow during pregnancy would increase the mitochondrial efficiency of offspring heart bioenergetics. This hypothesis was tested by isolating mitochondria using a mild-isolation procedure to assess mitochondrial ETC and supercomplex profiles. The procedure described here allowed for the processing of previously frozen archived heart tissues and eliminated the necessity of fresh mitochondria preparation for the assessment of mitochondrial ETC complexes, supercomplexes, and ETC complex activity profiles. This protocol describes the optimal ETC protein complex measurement in multiplexed antibody-based immunoblotting and super complex assessment using blue-native gel electrophoresis. SUMMARY Preparation of mitochondria-enriched samples from previously frozen archived solid tissues allowed the investigators to perform both functional and analytical assessments of mitochondria in various experimental modalities. This study demonstrates how to prepare mitochondria-enriched preparations from frozen heart tissue and perform analytical assessments of mitochondria.

Abstract Objective Blood-based biomarkers provide a crucial information in progress of neurodegenerative diseases with minimally invasive sampling method. Validated blood-based biomarker application in people with amyotrophic lateral sclerosis would derive numerous benefits. Canine degenerative myelopathy is a naturally occurring animal disease model to study the biology of human amyotrophic lateral sclerosis. Serum derived exosomes are potential carriers for cell-specific cargoes making them ideal venue to study biomarkers for a variety of diseases and biological processes. This study assessed the exosomal proteins that may be assigned as surrogate biomarker that may reflect biochemical changes in central nervous system. Methods Exosomes were isolated from canine serum using commercial exosome isolation reagents. Exosomes target proteins contents were analysed by Western blotting method. Results The profiles of potential biomarker candidates in spinal cord homogenate and that of serum-derived exosomes were found elevated in dogs with degenerative myelopathy as compare to control subjects. Conclusions Serum-derived exosomal biomolecules can serve as surrogate biomarkers in neuro degenerative diseases. Key Messages A canine with degenerative myelopathy can serve as a model animal to study human amyotrophic lateral sclerosis. Serum-derived exosomes contains Transactive Response DNA Binding Protein 43 (TDP-43), potential biomarker candidate. The levels of spinal cord TDP-43 proteins and that of serum-derived exosomes exhibited a similar profiling. Therefore, serum derived exosomes may be used as a venue for establishing blood-based biomarkers for neurodegenerative diseases.

During protein evolution, some amino acid substitutions modulate protein function (tuneability). In most proteins, the accessible tuneable range is wide and can be sampled by a set of protein variants that each contain multiple amino acid substitutions. In other proteins, the full range can be accessed by a set of variants that each contains a single substitution. Indeed, site-saturating substitutions at individual rheostat positions can sample the full range for some folded globular proteins. In proteins with intrinsically disordered regions (IDRs), many functional studies, which would also detect tuneability, used multiple substitutions or deleted small regions. These results have led to proposed mechanisms such as the acidic exposure model for transcriptional activation domains (AD). Only a few IDRs have been assessed with single substitutions. Results have been mixed: (i) The disordered ADs of two full-length transcription factors did not show tuneability, yet (ii) a fragment of another AD was tuneable by single substitutions. Here, we tested tuneability in the AD of a full-length, non-DNA-binding transcription factor, human class II transactivator (CIITA). Sequence analyses and experiments showed that AD of CIITA is an IDR. Functional assays of singly-substituted variants showed that this IDR was highly tuneable, and some outcomes were not predicted by the acidic exposure model. Instead, four tested positions showed rheostat behaviour, with a wide range of effects on transcriptional activation. Thus, tuneability of different IDRs can vary widely; future studies are needed to illuminate the biophysical features that govern whether an IDR can be tuned by single substitutions.