Lung cancer is the leading cause of cancer death worldwide. Recent data suggest that tumor-associated inflammatory cells may modify lung tumor growth and invasiveness. To determine the role of neutrophil elastase (encoded by Elane) on tumor progression, we used the loxP-Stop-loxP K-ras(G12D) (LSL-K-ras) model of mouse lung adenocarcinoma to generate LSL-K-ras-Elane(-/-) mice. Tumor burden was markedly reduced in LSL-K-ras-Elane(-/-) mice at all time points after induction of mutant K-ras expression. Kaplan-Meier survival analysis showed that whereas all LSL-K-ras-Elane(+/+) mice died, none of the mice lacking neutrophil elastase died. Neutrophil elastase directly induced tumor cell proliferation in both human and mouse lung adenocarcinomas by gaining access to an endosomal compartment within tumor cells, where it degraded insulin receptor substrate-1 (IRS-1). Immunoprecipitation studies showed that, as neutrophil elastase degraded IRS-1, there was increased interaction between phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and the potent mitogen platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), thereby skewing the PI3K axis toward tumor cell proliferation. The inverse relationship identified between neutrophil elastase and IRS-1 in LSL-K-ras mice was also identified in human lung adenocarcinomas, thus translating these findings to human disease. This study identifies IRS-1 as a key regulator of PI3K within malignant cells. Additionally, to our knowledge, this is the first description of a secreted proteinase gaining access to the inside of a cell and altering intracellular signaling.

To address the role of neutrophil elastase in pulmonary emphysema, neutrophil elastase-deficient mice and wild-type littermate controls were exposed to long-term cigarette smoke. Compared to wild-type littermates, mice that were deficient in neutrophil elastase were significantly protected (59%) from the development of emphysema. Previously, we demonstrated complete protection from emphysema in the absence of macrophage elastase. Further analysis revealed several interactions between these two elastases. Each elastase inactivated the endogenous inhibitor of the other, with neutrophil elastase degrading tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and macrophage elastase degrading α-1-antitrypsin. Cigarette smoke-induced recruitment of both neutrophils and monocytes was impaired in the absence of neutrophil elastase. Moreover, there was less macrophage elastase activity secondary to decreased macrophage accumulation in neutrophil elastase-deficient mice. This study demonstrates a direct role for neutrophil elastase in emphysema and highlights the interdependence of the proteinases and inflammatory cells that mediate lung destruction in response to cigarette smoke. To address the role of neutrophil elastase in pulmonary emphysema, neutrophil elastase-deficient mice and wild-type littermate controls were exposed to long-term cigarette smoke. Compared to wild-type littermates, mice that were deficient in neutrophil elastase were significantly protected (59%) from the development of emphysema. Previously, we demonstrated complete protection from emphysema in the absence of macrophage elastase. Further analysis revealed several interactions between these two elastases. Each elastase inactivated the endogenous inhibitor of the other, with neutrophil elastase degrading tissue inhibitor of metalloproteinase-1, and macrophage elastase degrading α-1-antitrypsin. Cigarette smoke-induced recruitment of both neutrophils and monocytes was impaired in the absence of neutrophil elastase. Moreover, there was less macrophage elastase activity secondary to decreased macrophage accumulation in neutrophil elastase-deficient mice. This study demonstrates a direct role for neutrophil elastase in emphysema and highlights the interdependence of the proteinases and inflammatory cells that mediate lung destruction in response to cigarette smoke. Pulmonary emphysema is a main component of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), currently the fourth leading cause of death in the United States and the only leading cause still increasing in prevalence. As cigarette smoking, the major risk factor for COPD, continues to be rampant worldwide, a major epidemic of COPD is looming.1MacKenzie TD Bartecchi CE Schrier RW The human costs of tobacco abuse.N Engl J Med. 1994; 330: 975-980Crossref PubMed Scopus (190) Google Scholar According to the “elastase:antielastase” hypothesis, cigarette smoke causes inflammation and subsequent release of proteolytic enzymes into the lung in excess of their natural inhibitors. In the absence of normal repair, proteolysis leads to tissue destruction and airspace enlargement. This elastase:antielastase hypothesis has dominated COPD research for nearly four decades. In 1963, Laurell and Eriksson2Laurell CB Eriksson S The electrophoretic α-globulin pattern of serum in α-antitrypsin deficiency.Scand J Clin Invest. 1963; 15: 132-140Google Scholar reported their observation that patients lacking α-1-antitrypsin (α1 AT), the major inhibitor of neutrophil elastase (NE), developed early onset emphysema. Soon thereafter, Gross et al3Gross P Pfitzer E Tolker E Babyak M Kaschak M Experimental emphysema: its production with papain in normal and silicotic rats.Arch Environ Health. 1965; 11: 50-58Crossref PubMed Scopus (246) Google Scholar instilled the elastase papain into rat lungs, resulting in emphysema. Subsequently, investigators were able to induce emphysema by instilling other elastolytic enzymes, including human neutrophil elastase,4Senior RM Griffin GL Mecham RP Chemotactic activity of elastin-derived peptides.J Clin Invest. 1980; 66: 859-862Crossref PubMed Scopus (413) Google Scholar, 5Janoff A Sloan B Weinbaum G Damiano V Sandhaus RA Elias J Kimbel P Experimental emphysema induced with purified human neutrophil elastase: tissue localization of the instilled protease.Am Rev Respir Dis. 1977; 115: 461-478PubMed Google Scholar, 6Snider GL Lucey EC Christensen TG Stone PJ Calure JD Cantanese A Franzblaa C Emphysema and bronchial secretory cell metaplasia induced in hamsters by human neutrophil products.Am Rev Respir Dis. 1984; 129: 155-160PubMed Google Scholar into the airways of experimental animals. Together, these observations firmly established NE as the proteinase most likely responsible for tissue destruction in emphysema. NE is a potent serine proteinase with a primary translational product of 267 amino acids and variable glycosylation, migrating with a molecular mass of 28 to 31 kd.7Sinha S Watorek W Karr S Giles J Bode W Travis J Primary structure of human neutrophil elastase.Proc Natl Acad Sci USA. 1987; 84: 2228-2232Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar NE is synthesized in the promyelocytic stage of myeloid development and stored in large quantities in its active form in neutrophil azurophil granules.8Takahashi H Nukiwa T Yoshimura K Quick CD States DJ Holmes MD Ejsmh-Peng J Knutsen T Crystal RJ Structure of the human neutrophil elastase gene.J Biol Chem. 1988; 263: 14739-14747Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar Catalytic activity is conferred by the His-Asp-Ser triad which forms a charge relay system, resulting in a powerful nucleophile capable of attacking peptide bond substrates. NE has potent catalytic activity against a broad array of extracellular matrix substrates, including the highly resistant elastin that imparts structural stability to the lung. However, macrophages are the primary inflammatory cell in the lower airspace under normal conditions, and particularly in response to long-term cigarette smoking. Macrophages also contain elastolytic enzymes, and we have previously demonstrated that gene-targeted mice deficient in macrophage elastase (MMP-12) are entirely protected from cigarette smoke-induced emphysema.9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar Taken together, the prominence of macrophage proteinases and the inconsistent linkage of NE to the “garden variety” emphysema10Eidelman D Saetta MP Ghezzo H Wang N-S Hoidal JR King M Cosio MG Cellularity of the alveolar walls in smokers and its relation to lung destruction: functional implications.Am Rev Respir Dis. 1990; 141: 1547-1552Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar associated with cigarette smoking led some investigators to question the role of NE in this disease process. To directly address the role of NE in emphysema, we generated mice deficient in NE by gene targeting,11Belaaouaj A McCarthy R Baumann M Gao Z Ley TJ Abraham SN Shapiro SD Mice lacking neutrophil elastase reveal impaired host defense against gram-negative bacterial sepsis.Nat Med. 1998; 4: 615-618Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar and subjected them and their wild-type littermates to long-term cigarette smoke exposure. NE-deficient (NE−/−) mice were significantly protected from the development of emphysema. Further analysis revealed many interactions between NE and MMP-12, as well as between neutrophils and macrophages, which lead to enzymatic lung destruction. Both NE11Belaaouaj A McCarthy R Baumann M Gao Z Ley TJ Abraham SN Shapiro SD Mice lacking neutrophil elastase reveal impaired host defense against gram-negative bacterial sepsis.Nat Med. 1998; 4: 615-618Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar and MMP-1212Shipley JM Wesselschmidt RL Kobayashi DK Ley TJ Shapiro SD Metalloelastase is required for macrophage-mediated proteolysis and matrix invasion in mice.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 3942-3946Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar gene-targeted mice were previously generated in this laboratory, each by replacement of sequence from intron 1 and exon 2 with neomycin phosphotransferase cDNA driven by the phosphoglycerate kinase promoter (PGK-neo). These constructs underwent homologous recombination in RW4 ES cells, and correctly targeted clones were injected into C57BL/6J blastocysts and transmitted into the germlines of mice as previously described.11Belaaouaj A McCarthy R Baumann M Gao Z Ley TJ Abraham SN Shapiro SD Mice lacking neutrophil elastase reveal impaired host defense against gram-negative bacterial sepsis.Nat Med. 1998; 4: 615-618Crossref PubMed Scopus (553) Google Scholar, 12Shipley JM Wesselschmidt RL Kobayashi DK Ley TJ Shapiro SD Metalloelastase is required for macrophage-mediated proteolysis and matrix invasion in mice.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 3942-3946Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar Mice homozygous for these mutations in a 129/Sv-C57BL/6J mixed background back-crossed at least eight generations into the C57BL/6J background were used for the current studies. The NE mutation did not alter expression of the closely linked gene encoding proteinase 3, nor did the MMP-12 mutation affect expression of neighboring MMP genes. Twenty-six NE−/− mice, 20 wild-type (NE+/+) littermates, and 12 MMP-12−/− mice, all 12 weeks of age, were subjected to two unfiltered cigarettes per day (University of Kentucky), 6 days per week for 6 months, with the use of a smoking apparatus as described.9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar Mice tolerated smoke exposure without toxicity; carboxyhemoglobin levels after two cigarettes were ∼10%. Twenty-four sham and non-smoke-exposed age-matched littermates were used as controls. Here and previously, sham chamber-exposed mice were equivalent to non-smoke-exposed mice. Following smoke exposure, each mouse was killed and saline was perfused through the right ventricle to remove blood. The left lung was ligated and removed for protein and RNA analysis. The right lung was inflated by instilling 3% gluteraldehyde in 0.1 mol/L cacodylate buffer to 25 cm H20 (for 15 minutes), and then ligated and removed. Inflated lungs were fixed for 48 hours before embedding in paraffin. Serial sagittal sections were obtained for morphological studies and histological analysis. Mid-sagittal sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) were used to calculate the chord length as previously described.9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar, 13Dunnill MS Quantitative methods in the study of pulmonary pathology.Thorax. 1962; 17: 320-328Crossref Scopus (394) Google Scholar All measurements were performed by a blinded investigator (S.D.S.), who calculated an average point count from 10 random fields at ×200 using NIH Image software.13Dunnill MS Quantitative methods in the study of pulmonary pathology.Thorax. 1962; 17: 320-328Crossref Scopus (394) Google Scholar Magnitude of changes were identical comparing manual intercepts [9] to NIH image results. Alveolar and interstitial macrophages were quantified by counting macrophages identified by murine mac-3 (rat antibody to mouse at 1:500 dilution; Pharmigen, San Diego, CA) immunostaining, using the avidin-biotin horseradish peroxidase technique with 3,3′-diaminobenzadine as the chromogenic substance.9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar, 12Shipley JM Wesselschmidt RL Kobayashi DK Ley TJ Shapiro SD Metalloelastase is required for macrophage-mediated proteolysis and matrix invasion in mice.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 3942-3946Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar Neutrophils were identified by H&E stain. Cell counts were determined by averaging the counts of five high-powered fields of mid-sagittal slices. Separate groups of smoke-exposed mice were used for these studies. Three separate 1-ml aliquots of saline were administered through an intravenous catheter placed in the trachea, and removed sequentially. Cell pellets were isolated and used to determine the total cell count, and aliquots were subjected to cytospin to determine differential cell counts. Bronchoalveolar lavage (BAL) is most reliable for quantifying neutrophil abundance, as neutrophils migrate directly from capillaries into the alveolar space, but less reliable for evaluating macrophage abundance, since many macrophages remain in the interstitial space. Lungs were removed en bloc, perfused with saline until free of blood, then frozen and homogenized in 1 ml of 50 mmol/L Tris (pH 7.2), 5 mmol/L CaCl2, and 150 mmol/L NaCl. Samples were normalized for total lung protein content for further analysis. A monospecific polyclonal antibody directed against human α1AT (DiaSorin Ins., Stillwater, MN), but which also reacted against and was specific for mouse α1AT, was used at a 1:500 dilution for Western blot analysis with enhanced chemiluminescence. Findings among mice of similar genotypes and treatment showed similar results. Data from three pooled samples loaded with equal protein content are shown. Total lung tissue extracts were prepared by perfusing (as above), removing the lungs en bloc, freezing them, and homogenizing them in 5 ml of 50 mmol/L Tris, 10 mmol/L CaCl2, and 150 mmol/L NaCl buffer. Following centrifugation, lyophilization, and equalization for total lung protein content, the samples were subjected to substrate 10% polyacrylamide gel electrophoresis using casein for zymography as described12Shipley JM Wesselschmidt RL Kobayashi DK Ley TJ Shapiro SD Metalloelastase is required for macrophage-mediated proteolysis and matrix invasion in mice.Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 3942-3946Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar and gelatin (1 mg/ml) for reverse zymography. After gel electrophoresis was performed at 4°C, gels were incubated in 2.5% (v/v) Triton for 30 minutes, then overnight in 50 mmol/L Tris (pH 8.0), 5 mmol/L CaCl, and 1 μmol/L ZnCl2 at 37°C. For reverse zymography, rat uterine explant conditioned medium was added to the Tris-Ca-Zn overnight buffer. As this medium has spontaneous gelatinase activity, proteinase inhibitors capable of blocking gelatin activation appear as dark blue bands following staining with 0.125% Coomassie blue. Again, results for mice of similar genotypes and treatment were equivalent. Data from pooled (three mice per lane) samples equally loaded by protein content are shown. To determine the contribution of NE to cigarette smoke-induced emphysema, we exposed groups of NE−/− and NE+/+ to cigarette smoke for a period of 6 months. (Note: 19 of 20 wild-type controls survived the cigarette smoke exposure protocol. There was no mortality in the other groups.) Age-matched sham and non-smoke-exposed littermates were used as controls. At the end of the 6 months, the mice were killed; their lungs were inflated to a fixed pressure, and H&E stained mid-sagittal sections were used to determine airspace enlargement. NE−/− smoke-exposed mice exhibited less airspace enlargement in response to cigarette smoke than NE+/+ mice (Figure 1). Quantification of chord length, a measure of airspace size and hence emphysema, demonstrated 59% protection (P = 0.002) against emphysema in NE−/− mice compared to wild-type littermates (Table 1). Similar to our previous findings,9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar a group of 12 MMP-12−/− mice (in the same genetic background as NE mice) failed to develop airspace enlargement in response to 6 months of cigarette smoke exposure (Table 1).Table 1Air-Space Enlargement in Response to Cigarette Smoke ExposureGroupnCL*Chord Length (CL) measures alveolar diameter. Values shown are the mean and standard error (in parentheses). Groups of mice, with the number of mice in each group identified (n), were either non-smoke-exposed (NS) or exposed to cigarette smoke (Sm). Wild-type mice (WT) were 129/SvXC57BL/6, the background of both mutant genotypes. P values comparing different groups were derived from two-tailed Student's t-test. (S.E.)% Increase with SmP value (vs NS)P value (vs WT Sm)WT (NS)2430.2 (0.5)——<0.0001WT (Sm)1936.8 (0.8)22<0.0001—NE−/− (NS)1430.4 (0.5)——NE−/− (Sm)2633.0 (0.6)9(0.1)0.002MMP-12−/− (NS)1229.9 (0.4)——MMP-12−/− (Sm)1229.8 (0.5)0(0.5)0.001* Chord Length (CL) measures alveolar diameter. Values shown are the mean and standard error (in parentheses). Groups of mice, with the number of mice in each group identified (n), were either non-smoke-exposed (NS) or exposed to cigarette smoke (Sm). Wild-type mice (WT) were 129/SvXC57BL/6, the background of both mutant genotypes. P values comparing different groups were derived from two-tailed Student's t-test. Open table in a new tab While macrophages are far more prevalent than neutrophils both at baseline and in response to cigarette smoke, we did observe a fivefold increase in neutrophil counts in the BAL fluid of wild-type mice following acute (not shown) and long-term cigarette smoke exposure. In contrast, there was no excess accumulation of neutrophils in the BAL fluid of smoke-exposed NE−/− mice (Figure 2A). Notably, total lung neutrophil abundance following smoke exposure was similar in NE−/− and NE+/+ mice. However, in mice lacking NE, most neutrophils remained in the blood vessels, unable to egress from the vasculature despite perfusing the right ventricle with saline before fixation (data not shown). This suggests a defect in neutrophil migration into the lung parenchyma in the absence of NE. With respect to macrophages, baseline numbers were unaffected by the genetic absence of NE. However, accumulation of macrophages in the lungs in response to long-term cigarette smoke was impaired ∼60% in NE−/− mice compared to wild-type NE+/+ mice (Figure 2B). As previously shown,9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar macrophage accumulation was markedly decreased following cigarette smoke exposure in MMP-12−/− mice (Figure 2B). As shown by casein zymography (Figure 3, lanes 1 and 2), and confirmed by Western blot (not shown), the fully processed, active 22-kd catalytic domain of MMP-12 was induced with smoking in the lungs of wild-type mice. In comparison, less active MMP-12 was present in lung homogenates of NE−/− mice (Figure 3, lanes 3 and 4). This was due to decreased macrophage accumulation, as well as to less proteolytic activation of pro-MMP-12 (55 kd, Figure 3, lane 4) in the absence of NE, and suggests that NE proteolytically activates MMP-12 in vivo. We also observed interactions between the proteinases and their endogenous inhibitors. The tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), of which there are four, are the major endogenous inhibitors of MMP activity. Multiple cell types produce TIMPs locally within tissues, including the lung. Previously, it was demonstrated that NE degrades TIMP-1 in vitro.14Okada Y Watanabe S Nakanishi I Kishi J Hayakawa T Watorek W Travis J Nagase H Inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinases by neutrophil elastase and other serine proteinases.FEBS Lett. 1988; 229: 157-160Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar To evaluate TIMP activity, we applied reverse zymography to lung tissue, and found enhanced TIMP activity only in smoke-exposed NE-deficient mice (Figure 4). While the protected TIMP band at ∼28 kd could correspond to either TIMP-1 or glycosylated TIMP-3, RT-PCR demonstrated the production of only TIMP-1 in these samples. Of note, there are no mouse TIMP antibodies developed to distinguish the two. However, these findings are consistent with NE-mediated destruction of TIMP-1 in smoke-exposed lungs. α1AT is produced predominantly in hepatocytes, released into the bloodstream, and deposited into extracellular spaces, including those in the lung, to protect against NE damage. In response to cigarette smoke, α1AT protein levels were at least as prominent in serum following cigarette smoke exposure in both wild-type and MMP-12-deficient mice (Figure 5, bottom). In the lung, however, α1AT levels were elevated in MMP-12−/− mice, but reduced by 50% in wild-type mice, following exposure to cigarettes (Figure 5, top). The role of NE in emphysema has been a cornerstone of the elastase:antielastase hypothesis. However, studies in humans have inconsistently shown an association of neutrophils and NE with emphysema. While some groups have found NE localized in destructive areas,15Damiano VV Tsang A Kucich U Abrams WR Rosenbloom J Kimbel P Fallahnejed M Weinbaum G Immunolocalization of elastase in human emphysematous lungs.J Clin Invest. 1986; 78: 482-493Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar others have demonstrated an inverse correlation between NE levels and airspace enlargement.10Eidelman D Saetta MP Ghezzo H Wang N-S Hoidal JR King M Cosio MG Cellularity of the alveolar walls in smokers and its relation to lung destruction: functional implications.Am Rev Respir Dis. 1990; 141: 1547-1552Crossref PubMed Scopus (92) Google Scholar Indeed, it is difficult to determine the cause of a dynamic process when limited to static “snapshots” of the disease, often years after initiation. One method to determine the relative contribution of an individual proteinase to the development of emphysema is to apply gene-targeted mice to a model that replicates the human disease. While humans and mice may differ considerably, exposure of mice to long-term cigarette smoke results in the inflammation and airspace enlargement characteristic of human emphysema. Using this model, we previously demonstrated that mice lacking the matrix metalloproteinase macrophage elastase (MMP-12) were entirely protected from airspace enlargement following cigarette smoke exposure.9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar These mice also had reduced macrophage accumulation in the lungs. Thus, in mice, macrophage accumulation and MMP-12 expression are sufficient to cause airspace enlargement. Human COPD is more complicated, with recurrent airway infections and hence greater neutrophil involvement. However, we did not expect neutrophils and NE to play prominent roles in a model of emphysema characterized by cigarette smoke-induced chronic low-grade inflammation in mice that are housed in a sterile barrier facility. Yet, our findings demonstrate a significant role for NE in the development of emphysema in mice. This effect is multifactorial, involving NE in inflammatory cell recruitment, extracellular matrix proteolysis, inactivation of TIMP-1, and likely activation of MMP-12. In fact, we observed significant interactions between the NE and MMP-12 proteolytic systems, with each augmenting the other's destructive capacity. With respect to endogenous inhibitors, we observed disappearance of the serine proteinase inhibitor α1AT by an MMP, and disappearance of the MMP inhibitor TIMP-1 by a serine proteinase, in cigarette smoke-exposed lungs. On cleavage of a suicide bond by NE, α1AT changes from a stressed to a relaxed conformation, thereby trapping and inactivating NE.16Huntington J Read R Carrell R Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation.Nature. 2000; 407: 923-926Crossref PubMed Scopus (970) Google Scholar This action accounts for >90% of the natural inhibition of NE, particularly in the lower airspace of the lung. MMPs also attack the reactive site of α1AT; however, in this case the molecule is inactivated without affecting MMP activity.17Desrochers P Jeffrey J Weiss S Interstitial collagenase (matrix metalloproteinase-1) expresses serpinase activity.J Clin Invest. 1991; 87: 2258-2265Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar, 18Sires U Murphy G Baragi V Fliszar C Welgus H Senior R Matrilysin is much more efficient than other matrix metalloproteinases in the proteolytic inactivation of α 1-antitrypsin.Biochem Biophys Res Commun. 1994; 204: 613-620Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar We have previously shown in vitro that MMP-12 is the most efficient MMP at degrading α1AT, being 10-fold more efficient than MMP-7 and over 100-fold more efficient than other MMPs.19Gronski TJ Martin R Kobayashi DK Walsh BC Holman MC Van Wart HE Shapiro SD Hydrolysis of a broad spectrum of extracellular matrix proteins by human macrophage elastase.J Biol Chem. 1997; 272: 12189-12194Crossref PubMed Scopus (272) Google Scholar Of note, as opposed to experiments in a test tube (with discrete, pure reagents and limited time of exposure) where discrete MMP-12-mediated α1AT breakdown products can be visualized, in vivo one can best appreciate disappearance of the intact α1AT (Figure 5). In a mouse model of bullous pemphigoid characterized by neutrophil inflammation, neutrophil-derived MMP-9 inactivated α1AT, allowing NE to cause blister formation.20Liu Z Zhou X Shapiro S Shipley J Twinning S Belaaouaj A Diaz L Senior R Werb Z α-1-proteinase inhibitor is the critical substrate for gelatinase B in experimental bullous pemphigoid.Cell. 2000; 102: 647-665Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (345) Google Scholar In the cigarette smoke-exposed mouse lung, where macrophage MMP-12 is the primary MMP and α1AT is abundant, MMP-12-mediated degradation of α1AT is dominant. It follows, therefore, that loss of α1AT would enhance NE-mediated lung destruction. Similarly, the serine proteinase NE is capable of cleaving and inactivating the MMP inhibitor TIMP-1 in vitro.14Okada Y Watanabe S Nakanishi I Kishi J Hayakawa T Watorek W Travis J Nagase H Inactivation of tissue inhibitor of metalloproteinases by neutrophil elastase and other serine proteinases.FEBS Lett. 1988; 229: 157-160Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar The current study demonstrates that TIMP-1 is the predominant TIMP expressed in the lung in response to cigarette smoke and disappearance of TIMP-1 in the presence of NE supports the concept that NE can degrade TIMP-1 in vivo, since enhanced TIMP-1 activity was only observed in smoke-exposed mice lacking NE. NE also had dramatic effects on both neutrophil and macrophage accumulation in the lungs in response to cigarette smoke. In the absence of NE, neutrophils had difficulty escaping the capillary to the lung interstitium and alveolar space. This was not due to an inability of neutrophils to penetrate basement membranes in the absence of NE, for we have previously demonstrated normal chemotaxis and Matrigel invasion in NE−/− mice.21MacIvor D Shapiro S Pham C Belaaouaj A Abraham S Ley T Normal neutrophil function in cathepsin G-deficient mice.Blood. 1999; 94: 4282-4293Crossref PubMed Google Scholar Importantly, others have failed to inhibit neutrophil migration using proteinase inhibitors of all classes.22Huber A Weiss S Disruption of the subendothelial basement membrane during neutrophil diapedesis in an in vitro construct of a blood vessel wall.J Clin Invest. 1989; 83: 1122-1136Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar, 23Mackarel A Cottell D Russell K FitzGerald M O'Connor C Migration of neutrophils across human pulmonary endothelial cells is not blocked by matrix metalloproteinase or serine protease inhibitors.Am J Respir Cell Mol Biol. 1999; 20: 1209-1219Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar Our results are consistent with a previously proposed concept that NE is required to dissociate the CD11/CD18-ICAM-1 complex tethering the neutrophil to the endothelium.24Loike J Sodeik B Cao L Leucona S Weitz J Detmers P Wright S Silverstein S CD11c/CD18 on neutrophils recognizes a domain at the N terminus of the A α chain of fibrinogen.Proc Natl Acad Sci USA. 1991; 88: 1044-1048Crossref PubMed Scopus (253) Google Scholar We also observed marked suppression of macrophage accumulation in the lungs in NE−/− mice exposed to cigarette smoke. In contrast to the neutrophil, the NE−/− peripheral blood monocyte does have impaired Matrigel penetration compared to wild-type controls (data not shown). This is consistent with previous findings that pro-inflammatory monocytes, those destined for transvascular migration into tissues, express significant amounts of NE.25Owen CA Campbell MA Boukedes SS Stockley RA Campbell EJ A discrete subpopulation of human monocytes expresses a neutrophil-like proinflammatory (P) phenotype.Am J Physiol. 1994; 267: 775-785Google Scholar It is plausible that surface-bound NE is required for the migration of these monocytes into the smoke-exposed lung. Here and previously,9Hautamaki RD Kobayashi DK Senior RM Shapiro SD Macrophage elastase is required for cigarette smoke-induced emphysema in mice.Science. 1997; 277: 2002-2004Crossref PubMed Scopus (1265) Google Scholar we found that MMP-12-deficient mice also had reduced monocyte recruitment following smoke exposure. The attenuation of this response, however, was due not to the inability of monocytes to egress from the vasculature, but rather to the absence of chemotactic stimuli in the lung. This, we believe, is at least in part due to reduced MMP-12-mediated generation of elastin fragments, which are known monocyte chemokines.4Senior RM Griffin GL Mecham RP Chemotactic activity of elastin-derived peptides.J Clin Invest. 1980; 66: 859-862Crossref PubMed Scopus (413) Google Scholar, 26Hunninghake GW Davidson JM Rennard S Szapiel S Gadek JE Crystal RG Elastin fragments attract macrophage precursors to diseased sites in pulmonary emphysema.Science. 1981; 212: 925-927Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar A similar mechanism may be at work in NE−/− mice. That is, NE may generate or activate other, as yet undefined, chemokines responsible for monocyte migration in response to cigarette smoke. In part due to the requirement of NE for macrophage accumulation in the lung, and in part to NE-mediated proteolytic activation of pro-MMP-12, there is less active MMP-12 in the lungs of smoke-exposed NE-deficient mice. Thus, protection from emphysema in NE−/− mice is likely secondary to NE's elastolytic activity, and attributable to the requirement of NE for recruitment of monocytes and their proteinases. The combination of a model of cigarette smoke exposure with gene-targeted mice has allowed us to determine the contribution of both neutrophil elastase and macrophage elastase to emphysema, and identify interactions between these proteinases. While mouse models may not entirely predict disease pathways in humans, the data suggest that if one could safely inhibit either of these classes of proteinases, one may be able to prevent further lung destruction in many patients with emphysema.

Mice lacking macrophage elastase (matrix metalloproteinase-12, or MMP-12) were previously shown to be protected from the development of cigarette smoke-induced emphysema and from the accumulation of lung macrophages normally induced by chronic exposure to cigarette smoke. To determine the basis for macrophage accumulation in experimental emphysema, we now show that bronchoalveolar lavage fluid from WT smoke-exposed animals contained chemotactic activity for monocytes in vitro that was absent in lavage fluid from macrophage elastase-deficient mice. Fractionation of the bronchoalveolar lavage fluid demonstrated the presence of elastin fragments only in the fractions containing chemotactic activity. An mAb against elastin fragments eliminated both the in vitro chemotactic activity and cigarette smoke-induced monocyte recruitment to the lung in vivo. Porcine pancreatic elastase was used to recruit monocytes to the lung and to generate emphysema. Elastin fragment antagonism in this model abrogated both macrophage accumulation and airspace enlargement.

Abstract The response rate to immune checkpoint inhibitor therapy for non-small-cell lung cancer (NSCLC) is just 20%. To improve this figure, several early phase clinical trials combining novel immunotherapeutics with immune checkpoint blockade have been initiated. Unfortunately, these trials have been designed without a strong foundational knowledge of the immune landscape present in NSCLC. Here, we use a flow cytometry panel capable of measuring 51 immune cell populations to comprehensively identify the immune cell composition and function in NSCLC. The results show that the immune cell composition is fundamentally different in lung adenocarcinoma as compared with lung squamous cell carcinoma, and that neutrophils are the most prevalent immune cell type. Using T-cell receptor-β sequencing and tumour reactivity assays, we predict that tumour reactive T cells are frequently present in NSCLC. These results should help to guide the design of clinical trials and the direction of future research in this area.

Abstract Myeloperoxidase (MPO) is a heme peroxidase that is mainly expressed and secreted by neutrophils. MPO’s role in inflammatory diseases has been highlighted in recent years, but its role in tumor development remains unclear. Therefore, we investigated the role of MPO in non-small cell lung cancer (NSCLC). In silico analysis revealed a survival benefit in patients with NSCLC and low MPO expression. Furthermore, a syngeneic tumor model using MPO knockout (KO) mice revealed that mice lacking MPO had lower tumor growth than controls. The reduction in tumor size was accompanied by an increase in lymphoid populations, including natural killer cells and CD8 + T cells, suggesting a shift to a more anti-tumorigenic immune environment in MPO-KO mouse tumors. The T cell induced interferon-gamma (IFN-γ) expression was increased in MPO-KO tumors, indicating increased tumoricidal activity. CD8 depletion abolished the previously observed reduction in tumor size in MPO-KO mice, indicating that CD8 + T cells play an important role. In vitro , T cells treated with MPO showed reduced proliferation and IFN-γ expression. Furthermore, MPO could be internalized into T cells. Heparin pretreatment of T cells blocked MPO binding and internalization into T cells and reversed MPO-induced proliferation reduction. Interestingly, MPO + lymphocytes were found in tumor samples from patients with NSCLC. Our findings suggest that MPO plays an immunosuppressive role in NSCLC. One Sentence Summary High myeloperoxidase (MPO) expression in non-small cell lung cancer patients is a predictor for adverse outcome and mice lacking MPO showed enhanced anti-tumorigenic leukocyte infiltration, suggesting a pro-tumorigenic role of MPO.

ABSTRACT MGA, a transcription factor and member of the MYC network, is mutated or deleted in a broad spectrum of malignancies. As a critical test of a tumor suppressive role, we inactivated Mga in two mouse models of non-small cell lung cancer using a CRISPR based approach. MGA loss significantly accelerated tumor growth in both models and led to de-repression of atypical Polycomb PRC1.6, E2F and MYC-MAX targets. Similarly, MGA depletion in human lung adenocarcinoma lines augmented invasive capabilities. We further show that MGA, E2F6 and L3MBTL2 co-occupy thousands of promoters and that MGA stabilizes PRC1.6 subunits. Lastly, we report that MGA loss has also a pro-growth effect in human colon organoids. Our studies establish MGA as a bona fide tumor suppressor in vivo and suggest a tumor suppressive mechanism in adenocarcinomas resulting from widespread transcriptional attenuation of MYC and E2F targets mediated by an atypical Polycomb complex containing MGA-MAX dimers.

8622 Background: Chemotherapy and immune checkpoint inhibitors (chemoICI) for stage IV NSCLC without driver mutations produce variable response patterns and outcomes. Early assessment could establish selective benefit from treatment (de)escalation, consolidation, or adaptation. We evaluated FDG PET imaging and circulating T cell repertoire biomarkers of chemoICI response for clinical decision support. Methods: 35 patients with stage IV NSCLC prospectively enrolled on PET BRIGHT (NCT04151940) from 2019-2023 and received first-line carboplatin-pemetrexed-pembrolizumab. Synchronous FDG PET/CT and peripheral blood draws were performed prior to and after first dose of chemoICI at week 3. Imaging biomarkers included standardized uptake value (SUV) and total lesion glycolysis (TLG) metrics within the primary metabolic tumor volume and across lung lesions. Immunophenotyping included T cell receptor (TCR) sequencing from which TCR diversity metrics were extracted. Spearman correlation of FDG PET and TCR biomarkers with bi-dimensional size reduction after initial chemoICI was estimated. ROC analysis of PET and TCR biomarkers to discriminate chemoICI response status was benchmarked against PD-L1 testing, along with Mann-Whitney testing of groupwise differences. Results: The majority tested negative for PD-L1 (58% TPS<1%). Most patients (63%) had partial response (PR) to initial chemoICI versus 33% with stable disease (SD) and 4% with progressive disease (PD). FDG PET primary tumor peak SUV decreased by a median of 15% [-82%, 63%] at week 3, while TLG decreased by 36% [-55%, 83%]. Higher baseline peak SUV and TLG, along with greater decline after first dose, were correlated with post-chemoICI size reduction (R 0.43-0.64, p=0.001-0.036). PR patients had higher baseline peak SUV (12 vs 6 g/mL, p=0.014) and greater week 3 decline in TLG (39% vs 7%, p=0.032) relative to SD/PD patients. Across lung lesions, PR-patient maximum SUV decreased while SD/PD-patient maximum SUV increased at week 3 (20% vs -19%, p=0.010). FDG PET biomarkers were stronger discriminators of chemoICI response status (AUC 0.75-0.82, p=0.009-0.046) than PD-L1 (AUC 0.60, p=0.42). Higher baseline blood TCR Simpson clonality was positively correlated with size reduction (R 0.70, p=0.004), whereas TCR Pielou evenness was negatively correlated (R -0.68, p=0.006). Higher baseline TCR clonality / lower TCR evenness discriminated chemoICI response status (AUC 0.80-0.84, p=0.028-0.049). TCR diversity changes were uncorrelated with response. Conclusions: FDG PET imaging prior to and after first dose chemoICI, along with baseline circulating T cell repertoire biomarkers, predict future response. Further investigation of these patient- and lesion-level biomarkers to guide personalized (de)escalation, consolidation, or adaptation of regimens for stage IV NSCLC is warranted. Clinical trial information: NCT04151940 .

8527 Background: Despite the vast amount of T cell receptor (TCR) sequencing data generated from patients undergoing immune checkpoint inhibition (ICI), the clinical insights gained from interrogating antigen-specific T cell responses have been limited. Napsin A is a self-antigen normally expressed in lung parenchyma and highly expressed as a cancer antigen in lung adenocarcinoma. A prior study demonstrated enrichment of Napsin A-specific clonotypes within lung tumors and increased frequency of Napsin A-specific CD8+ IFNγ+ cells among patients with response to ICI (Berner et al 2022 Science Immunol). This finding suggests that T cell responses against Napsin A may be relevant to ICI-mediated anti-tumor responses and might offer a mechanistic link between tumor control and immune adverse events involving the lungs. We examined this hypothesis utilizing TCR repertoire data and assessed whether Napsin A-specific clonotypes are more abundant in the blood of patients with durable clinical benefit to ICI compared to patients with progressive disease. Methods: Patients with metastatic NSCLC receiving anti-PD-1 (alone or in combination, 1 st -4 th line) were enrolled at Fred Hutchinson Cancer Center and Stanford University Medical Center (n = 61; histology of adenocarcinoma n = 48, squamous n = 9, NSCLC/other n = 4). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were collected for genomic DNA isolation at pre- and post-treatment (range 3 weeks - 3 months, single post-treatment sample per patient). TCRß was sequenced at survey and deep level via the immunoSEQ platform (Adaptive Biotechnologies). Publicly available TCRß sequences specific for Napsin A (n= 42) were obtained from Berner et al. The frequency of Napsin-A specific TCRß sequences were quantified in each patient sample. Patient demographics, durable clinical benefit (DCB) at 6 months (DCB n = 30, progressive disease n = 31), progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) were captured from chart review. High versus low frequency of Napsin A-specific TCRs were defined as above/below the median for PFS and OS analysis. Results: Napsin A-specific clonotypes were significantly enriched within 3 months after treatment in patients achieving DCB from ICI compared to patients without DCB (p = 0.037 post-treatment, n = 41). Patients with a higher frequency of Napsin A-specific TCRs had a significant improvement in OS compared to patients with a lower frequency of these clonotypes (p = 0.006 pre-treatment; p = 0.016 post-treatment). Conclusions: A higher frequency of Napsin A-specific T cell clonotypes is associated with DCB and improved OS with ICI in patients with NSCLC. T cell immune responses recognizing the tumor antigen Napsin A may play a role in shaping ICI responses, a finding that warrants further investigation in larger datasets.