The axon initial segment (AIS) constitutes not only the site of action potential initiation, but also a hub for activity-dependent modulation of output generation. Recent studies shedding light on AIS function used predominantly post hoc approaches since no robust murine in vivo live reporters exist. Here, we introduce a reporter line in which the AIS is intrinsically labeled by an ankyrin-G-GFP fusion protein activated by Cre recombinase, tagging the native Ank3 gene. Using confocal, superresolution, and two-photon microscopy as well as whole-cell patch-clamp recordings in vitro, ex vivo , and in vivo , we confirm that the subcellular scaffold of the AIS and electrophysiological parameters of labelled cells remain unchanged. We further uncover rapid AIS remodeling following increased network activity in this model system, as well as highly reproducible in vivo labeling of AIS over weeks. This novel reporter line allows longitudinal studies of AIS modulation and plasticity in vivo in real time and thus provides a unique approach to study subcellular plasticity in a broad range of applications.

Pupillometry, the measure of pupil size and reactivity, has been widely used to assess cognitive processes. As such, changes in pupil size have been shown to correlate with arousal, locomotion, cortical state and decision-making processes. In addition, pupillary responses have been linked to the activity of neuromodulatory systems that modulate attention and perception as the noradrenergic and cholinergic systems. Due to the extent of processes reflected by the pupil, we aimed at resolving pupillary responses in context of behavioral state and task performance while recording pupillary transients of mice performing a vibrotactile two-alternative forced choice task (2-AFC). We show that pre-stimulus pupil size differentiates between states disengagement from task performance versus when actively engaged. In addition, when actively engaged, post-stimulus, pupillary dilations for correct responses are larger than for error responses with this difference reflecting response confidence. Importantly, in a delayed 2-AFC task we show that even though pupillary transients mainly reflect motor output following the response of the animal, they also reflect animal decision confidence prior to its response. Finally, in a condition of passive engagement, when stimulus has no task relevance with reward provided automatically, pupillary dilations rather reflect stimulation and reward and are reduced relative to a state of active engagement explained by shifts of attention from irrelevant task occurrences. Our results provide further evidence of how pupillary dilations reflect cognitive processes in a task relevant context, showing that the pupil reflects response confidence and baseline pupil size encodes attentiveness rather than general arousal.

Cortical and limbic brain areas are regarded as centres for learning. However, how thalamic sensory relays participate in plasticity upon associative learning, yet support stable long-term sensory coding remains unknown. Using a miniature microscope imaging approach, we monitor the activity of populations of auditory thalamus (MGB) neurons in freely moving mice upon fear conditioning. We find that single cells exhibit mixed selectivity and heterogeneous plasticity patterns to auditory and aversive stimuli upon learning, which is conserved in amygdala-projecting MGB neurons. In contrast to individual cells, population level encoding of auditory stimuli remained stable across days. Our data identifies MGB as a site for complex neuronal plasticity in fear learning upstream of the amygdala that is in an ideal position to drive plasticity in cortical and limbic brain areas. These findings suggest that MGB's role goes beyond a sole relay function by balancing experience-dependent, diverse single cell plasticity with consistent ensemble level representations of the sensory environment to support stable auditory perception with minimal affective bias.

Summary During perceptually guided decisions, correlates of choice are found as upstream as in the primary sensory areas. However, how well these choice signals align with early sensory representations, a prerequisite for their interpretation as feedforward substrates of perception, remains an open question. We designed a two alternative forced choice task (2AFC) in which mice compared stimulation frequencies applied to two adjacent vibrissae. The optogenetic silencing of individual columns in the primary somatosensory cortex (wS1) resulted in predicted shifts of psychometric functions, demonstrating that perception depends on focal, early sensory representations. Functional imaging of layer II/III single neurons revealed sensory, choice and engagement coding. From trial to trial, these three varied substantially, but independently from one another. Thus, coding of sensory and non-sensory variables co-exist in orthogonal subspace of the population activity, suggesting that perceptual variability does not originate from wS1 but rather from state or choice fluctuations in downstream areas.

Abstract During perceptually guided decisions, correlates of choice are found as upstream as in the primary sensory areas. However, how well these choice signals align with early sensory representations, a prerequisite for their interpretation as feedforward substrates of perception, remains an open question. We designed a two alternative forced choice task (2AFC) in which male mice compared stimulation frequencies applied to two adjacent vibrissae. The optogenetic silencing of individual columns in the primary somatosensory cortex (wS1) resulted in predicted shifts of psychometric functions, demonstrating that perception depends on focal, early sensory representations. Functional imaging of layer II/III single neurons revealed mixed coding of stimuli, choices and engagement in the task. Neurons with multi-whisker suppression display improved sensory discrimination and had their activity increased during engagement in the task, enhancing selectively representation of the signals relevant to solving the task. From trial to trial, representation of stimuli and choice varied substantially, but mostly orthogonally to each other, suggesting that perceptual variability does not originate from wS1 fluctuations but rather from downstream areas. Together, our results highlight the role of primary sensory areas in forming a reliable sensory substrate that could be used for flexible downstream decision processes.