Abstract Inflammation driven by the NLRP3 inflammasome is coordinated through multiple signaling pathways and with a poorly defined regulation by sub-cellular organelles. Here, we tested the hypothesis that NLRP3 senses disrupted endosome trafficking to trigger inflammasome formation and inflammatory cytokine secretion. NLRP3-activating stimuli disrupted endosome trafficking and triggered localization of NLRP3 to vesicles positive for endosome markers and the inositol lipid PtdIns4P. Chemical disruption of endosome trafficking sensitized macrophages to the NLRP3 activator imiquimod driving enhanced inflammasome activation and cytokine secretion. Together these data suggest that NLRP3 is capable of sensing disruptions in the trafficking of endosomal cargoes, and that this may explain in part the spatial activation of the NLRP3 inflammasome complex. These data highlight new mechanisms amenable for the therapeutic targeting of NLRP3. One-Sentence Summary NLRP3 senses disruptions in endosome trafficking to trigger the formation of an inflammasome complex and initiate an inflammatory response.

The risk of early recurrent events after stroke remains high despite currently established secondary prevention strategies1. Risk is particularly high in patients with atherosclerosis, with more than 10% of patients experiencing early recurrent events1,2. However, despite the enormous medical burden of this clinical phenomenon, the underlying mechanisms leading to increased vascular risk and recurrent stroke are largely unknown. Here, using a novel mouse model of stroke-induced recurrent ischaemia, we show that stroke leads to activation of the AIM2 inflammasome in vulnerable atherosclerotic plaques via an increase of circulating cell-free DNA. Enhanced plaque inflammation post-stroke results in plaque destabilization and atherothrombosis, finally leading to arterioarterial embolism and recurrent stroke within days after the index stroke. We confirm key steps of plaque destabilization also after experimental myocardial infarction and in carotid artery plaque samples from patients with acute stroke. Rapid neutrophil NETosis was identified as the main source of cell-free DNA after stroke and NET–DNA as the causative agent leading to AIM2 inflammasome activation. Neutralization of cell-free DNA by DNase treatment or inhibition of inflammasome activation reduced the rate of stroke recurrence after experimental stroke. Our findings present an explanation for the high recurrence rate after incident ischaemic events in patients with atherosclerosis. The detailed mechanisms uncovered here provide clinically uncharted therapeutic targets for which we show high efficacy to prevent recurrent events. Targeting DNA-mediated inflammasome activation after remote tissue injury represents a promising avenue for further clinical development in the prevention of early recurrent events. This study describes sensing of circulating cell-free DNA after stroke as the mechanism leading to recurrent ischemic events.

Abstract Inflammation driven by DNA sensors is now understood to be central to disease pathogenesis. Here we describe new inhibitors of pathogenic DNA sensing, primarily of the inflammasome forming sensor AIM2. Molecular modelling and biochemistry has revealed potent inhibitors of AIM2 that work by binding competitively to the DNA binding site. Though less potent, these AIM2 inhibitors, 4-sulfonic calixarenes, also inhibit DNA sensors cGAS and TLR9 demonstrating a broad utility against pathogenic DNA-driven inflammatory responses. The 4-sulfonic calixarenes inhibited AIM2 dependent post-stroke T cell death, highlighting a proof of concept that the 4-sulfonic calixarenes could be effective at combatting post-stroke immunosuppression. By extension, we propose a broad utility against DNA driven inflammation in disease. Finally, we reveal that the ancient drug suramin, by virtue of its structural similarities, is an excellent inhibitor of DNA-dependent inflammation and propose that suramin could be rapidly repurposed to meet an ever increasing clinical need.

Abstract The NLRP3 inflammasome is a multi-molecular protein complex that converts inactive cytokine precursors into active forms of IL-1β and IL-18. The NLRP3 inflammasome is frequently associated with the damaging inflammation of non-communicable disease states and is considered a therapeutic target. However, there is much regarding the mechanism of NLRP3 activation that remains unknown. Chloride efflux is suggested as an important step in NLRP3 activation, but the identity of which chloride channels are involved is still unknown. We used chemical, biochemical, and genetic approaches to establish the importance of Cl - channels in the regulation of NLRP3 activation. Specifically we identify LRRC8A, an essential component of volume-regulated anion channels (VRAC), as a vital regulator of hypotonicity-induced, but not DAMP-induced, NLRP3 inflammasome activation. Although LRRC8A was dispensable for canonical DAMP-dependent NLRP3 activation, this was still sensitive to Cl - channel inhibitors, suggesting there are additional and specific Cl - sensing and regulating mechanisms controlling NLRP3.

Abstract The NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex that regulates the protease caspase-1 and subsequent interleukin (IL)-1β release from cells of the innate immune system, or microglia in the brain, in response to infection or injury. Derivatives of the metabolites itaconate and fumarate, dimethyl itaconate (DMI), 4-octyl itaconate (4OI) and dimethyl fumarate (DMF), limit both expression of IL-1β, and IL-1β release following NLRP3 inflammasome activation. However, the direct effects of these metabolite derivatives on NLRP3 inflammasome responses in macrophages and microglia require further investigation. Using murine bone marrow-derived macrophages, mixed glia and organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs), we demonstrate that DMI and 4OI pre-treatment limited IL-1β, IL-6 and tumor necrosis factor production in response to lipopolysaccharide (LPS) priming, as well as inhibiting subsequent NLRP3 inflammasome activation. DMI, 4OI, DMF and monomethyl fumarate (MMF), another fumarate derivative, also directly inhibited biochemical markers of NLRP3 activation in LPS-primed macrophages, mixed glia and OHSCs, including ASC speck formation, caspase-1 activation, gasdermin D cleavage and IL-1β release. Finally, DMF, an approved treatment for multiple sclerosis, as well as DMI, 4OI and MMF, inhibited NLRP3 activation in macrophages in response to the phospholipid lysophosphatidylcholine, which is used to induce demyelination, suggesting a possible mechanism of action for DMF in multiple sclerosis through NLRP3 inhibition. Together, these findings reveal the importance of immunometabolic regulation for both the priming and activation steps of NLRP3 activation in macrophages and microglia. Furthermore, we highlight itaconate and fumarate derivatives as a potential therapeutic option in NLRP3-driven diseases, including in the brain. Summary statement We show that itaconate and fumarate derivatives inhibit both the priming and activation steps of NLRP3 inflammasome responses in macrophages and microglia, revealing the importance of immunometabolic NLRP3 regulation.

Hyperinflammatory disease is associated with an aberrant immune response resulting in cytokine storm. One such instance of hyperinflammatory disease is known as macrophage activation syndrome (MAS). The pathology of MAS can be characterised by significantly elevated serum levels of interleukin (IL)-18 and interferon (IFN)-γ. Given the role for IL-18 in MAS, we sought to establish the role of inflammasomes in the disease process. Using a murine model of CpG-DNA induced MAS, we discovered that the expression of the NLRP3 inflammasome was increased and correlated with IL-18 production. Inhibition of the NLRP3 inflammasome, or downstream caspase-1, prevented MAS-mediated upregulation of plasma IL-18 but interestingly did not alleviate key features of hyperinflammatory disease including hyperferritinaemia and splenomegaly. Furthermore IL-1 receptor blockade with IL-1Ra did not prevent the development of CpG-induced MAS, despite being clinically effective in the treatment of MAS. These data demonstrate that in the development of MAS, the NLRP3 inflammasome was essential for the elevation in plasma IL-18, a key cytokine in clinical cases of MAS, but was not a driving factor in the pathogenesis of CpG-induced MAS.

Over the past decade, the spotted wing Drosophila, Drosophila suzukii, has invaded Europe and America and has become a major agricultural pest in these areas, thereby prompting intense research activities to better understand its biology. Two draft genome assemblies based on short-read sequencing were released in 2013 for this species. Although valuable, these resources contain pervasive assembly errors and are highly fragmented, two features limiting their values. Our purpose here was to improve the assembly of the D. suzukii genome. For this, we generated PacBio long-read sequencing data at 160X sequence coverage and assembled a novel, contiguous D. suzukii genome. We obtained a high-quality assembly of 270 Mb (with 546 contigs, a N50 of 2.6Mb, a L50 of 15, and a BUSCO score of 95%) that we called WT3-2.0. We found that despite 16 rounds of full-sib crossings the D. suzukii strain that we sequenced has maintained high levels of polymorphism in some regions of its genome (ca. 19Mb). As a consequence, the quality of the assembly of these regions was reduced. We explored possible origins of this high residual diversity, including the presence of structural variants and a possible heterogeneous admixture pattern of North American and Asian ancestry. Overall, our WT3-2.0 assembly provides a higher quality genomic resource compared to the previous one in terms of general assembly statistics, sequence quality and gene annotation. This new D. suzukii genome assembly is therefore an improved resource for high-throughput sequencing approaches, as well as manipulative genetic technologies to study D. suzukii.

Abstract Excessive or aberrant NLRP3 inflammasome activation has been implicated in the progression and initiation of many inflammatory conditions; however, currently no NLRP3 inflammasome inhibitors have been approved for therapeutic use in the clinic. Here we have identified that the natural product brazilin effectively inhibits both priming and activation of the NLRP3 inflammasome in cultured murine macrophages, a human iPSC microglial cell line and in a mouse model of acute peritoneal inflammation. Through computational modelling, we predict that brazilin can adopt a favourable binding pose within a site of the NLRP3 protein which is essential for its conformational activation. Our results not only encourage further evaluation of brazilin as a therapeutic agent for NLRP3-related inflammatory diseases, but also introduce this small-molecule as a promising scaffold structure for the development of derivative NLRP3 inhibitor compounds.

Summary The risk of early recurrent events after stroke remains high despite currently established secondary prevention strategies. Risk is particularly high in patients with atherosclerosis, with more than 10% of patients experiencing early recurrent events. However, despite the enormous medical burden of this clinical phenomenon, the underlying mechanisms leading to increased vascular risk and recurrent stroke are largely unknown. Here, using a novel mouse model of stroke-induced recurrent ischemia, we show that stroke leads to activation of the AIM2 inflammasome in vulnerable atherosclerotic plaques via an increase of circulating cell-free DNA from the ischemic tissue. Enhanced plaque inflammation post-stroke results in plaque destabilization and atherothrombosis, finally leading to arterio-arterial embolism and recurrent stroke within days after the index stroke. We confirm key steps of plaque destabilization also after experimental myocardial infarction and in carotid artery plaque samples from patients with acute stroke. Neutralization of cell-free DNA by DNase treatment or inhibition of inflammasome activation reduced the rate of stroke recurrence after experimental stroke. Our findings present an explanation for the high recurrence rate after incident ischemic events in atherosclerotic patients. The detailed mechanisms uncovered here provide so far clinically uncharted therapeutic targets for which we show high efficacy to prevent recurrent events. Targeting DNA-mediated inflammasome activation after remote tissue injury represents a promising avenue for further clinical development in the prevention of early recurrent events.

Abstract Interleukin (IL)-1α is a suggested dual-function cytokine that diverged from IL-1β in mammals potentially by acquiring additional biological roles that relate to highly conserved regions in the pro-domain of IL-1α, including a nuclear localisation sequence (NLS) and histone acetyl transferase (HAT)-binding domains. Why evolution modified pro-IL-1α’s subcellular location and protein interactome, and how this shaped IL-1α’s intracellular role, is unknown. TurboID proximity labelling with pro-IL-1α suggested a nuclear role for pro-IL-1α that involved interaction with HATs, including EP300. We also identified and validated inactivating mutations in the pro-IL-1α NLS of multiple mammalian species. However, HAT-binding domains were also conserved in species that had lost pro-IL-1α nuclear localisation. Together, these data suggest that HAT binding and nuclear localisation occurred together, and that while some species lost the NLS in their pro-IL-1α, HAT binding was maintained. The NLS was lost from several distinct species at different evolutionary times, suggesting convergent evolution, and that the loss of the NLS confers some important biological outcome.